【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于东风螺养殖的，更具体地，涉及一种胚胎保存液及其冷冻保存方法和在东风螺胚胎冷冻保存中的应用。
技术介绍
1、东风螺俗称花螺、黄螺，隶属于软体动物门(mollusca)、腹足纲(gastropoda)、前鳃亚纲(prosobranchia)、新腹足目(neogastropoda)、蛾螺科(buccinidae)、东风螺属(babylonia)。因东风螺肉质鲜美、营养丰富，深受消费者喜爱，具有广阔的市场前景，东风螺养殖规模和养殖面积逐年扩大，东风螺的人工养殖迅速发展。
2、冷冻保存技术自问世以来，成为自然科学领域不可缺少的研究方法之一，已被广泛采用。随着生活水平的提高和医学技术的发展，冷冻保存技术不仅对于人类生殖细胞(精子、卵母细胞)、性腺组织等的冷冻保存至关重要；而且对于水产动物的资源保护、增殖养殖、育种改良以及生物学基础研究也具有重要意义。
3、目前最常用的冷冻保存方法为玻璃化冷冻法，玻璃化冷冻法的一般操作为：通过逐级降温将高浓度的冷冻保护剂在超低温环境下凝固，形成不规则的玻璃化样固体，保存了液态时正常分子和离子分布，因而在细胞内发生玻璃化时能起到保护作用。所保存细胞在冷冻保护液中脱水到一定程度后，则引起内源性胞质大分子如蛋白质渗透到胞内的冷冻保护剂浓缩，从而使细胞在剧烈的快速降温中得到保护。
4、目前，国内外关于水产动物精子、卵细胞的低温保存研究较多，而对胚胎的保存较少，对东风螺胚胎保存技术更是尚未见报道。专利cn109819977a公开了一种凡纳滨对虾胚胎的冷冻保存方法，先用抗
5、但是使用这些保存液对东风螺胚胎进行玻璃化冷冻保存，容易发生变型，解冻后的东风螺胚体出现破裂等现象；此外，容易感染细菌发生溶解，影响东风螺胚胎后续正常发育和存活，不能满足东风螺胚胎保存的要求，即现有玻璃化液并不适合东风螺胚胎的冷冻保存。因此，如何提供一种适用于东风螺胚胎的保存液及保存方法成为亟需解决的技术问题。
技术实现思路
1、针对上述现有的技术问题，本专利技术的首要目的在于提供一种胚胎保存液，所述胚胎保存液能够有效保存东风螺胚胎，固定东风螺胚胎的状态，延缓胚胎的生物发育进程，较好地提高了冷冻后东风螺胚胎的成活率和孵化率，满足了东风螺研究和养殖的需求。
2、本专利技术的第二个目的在于提供一种胚胎保存液的制备方法。
3、本专利技术的第三个目的在于提供一种胚胎保存液在东风螺胚胎冷冻保存中的应用。
4、本专利技术的第四个目的在于提供一种东风螺胚胎的冷冻保存方法。
5、本专利技术的第五个目的在于提供一种东风螺胚胎的冷冻保存方法在东风螺胚胎冷冻保存中的应用。
6、为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：
7、一种胚胎保存液，以1l溶剂计，所述胚胎保存液包括：1.0～4.0g/l乙酰胺、0.01～0.04g/l n-乙酰半胱氨酸、0.04～0.06g/l聚乙烯醇、0.02～0.06g/l抑菌剂、0.3～0.6g/l缓冲剂、15～30g/l碳源。
8、本专利技术提供了一种胚胎的保存液，选用乙酰胺作为抗冻剂，专利技术人通过研究发现，相对于其他抗冻剂而言，乙酰胺能够更有效地保护东风螺胚胎，降低东风螺胚胎外液的冰点，减少东风螺胚胎外冰晶形成，并更能够促使东风螺胚胎内部的水分外流，从而最终减少东风螺胚胎内部冰晶的形成。
9、进一步地，本专利技术采用n-乙酰半胱氨酸作为抗氧化剂，聚乙烯醇作为稳定剂，专利技术人通过研究发现，相对于其他抗氧化剂而言，n-乙酰半胱氨酸更能够清除东风螺胚胎代谢过程中产生的自由基，维持细胞内的氧化还原环境，防止冷冻保存过程中的细胞凋亡。而聚乙烯醇能够保持东风螺胚胎的活性，且对于东风螺胚胎具有良好的适应性，能够提高胚胎的抗渗透压作用。
10、进一步地，胚胎保存液中还含有抗菌剂，具有较好的抑菌效果，能够防止东风螺胚胎感染细菌，发生溶解，且低毒。而缓冲剂作为渗透压缓冲液，能够维持组织细胞渗透压的盐离子浓度和维持生理环境ph稳定，提供了合适的渗透压和酸碱度，保持了胚胎的活性，提高胚胎的抗渗透压作用。碳源可作为胚胎的能量底物，提供能量以维持胚胎最低的生理代谢条件，维持胚胎长期的保存。
11、在上述特定组合的协同作用下，大大延缓了东风螺胚胎的生物发育进程，保持东风螺胚胎的细胞活性，降低细胞新陈代谢，减少细胞死亡或者程序性凋亡，东风螺胚胎解冻后能够发挥胚胎原有的功能，恢复胚胎的发育。
12、优选地，以1l溶剂计，所述胚胎保存液包括：2.0～3.0g/l乙酰胺、0.02～0.03g/ln-乙酰半胱氨酸、0.05～0.06g/l聚乙烯醇、0.03～0.05g/l抑菌剂、0.4～0.5g/l缓冲剂、20～25g/l碳源。
13、优选地，所述抑菌剂选自恩诺沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素中的一种或多种。
14、优选地，所述缓冲剂选自磷酸二氢钾、碳酸二氢钠、碳酸二氢钾中的一种或多种。
15、优选地，所述碳源选自海藻糖、葡萄糖、果糖中的一种或多种。
16、进一步地，本专利技术请求保护一种胚胎保存液的制备方法，将乙酰胺、n-乙酰半胱氨酸、聚乙烯醇、抑菌剂、缓冲剂、碳源、溶剂混合，搅拌均匀，获得所述胚胎保存液。
17、进一步地，本专利技术请求保护一种胚胎保存液在东风螺胚胎冷冻保存中的应用。
18、进一步地，本专利技术请求保护一种东风螺胚胎的冷冻保存方法，将东风螺胚胎进行前处理去除胚乳液，随后采用上述胚胎保存液对东风螺胚胎进行逐级降温，冷冻保存。
19、优选地，东风螺胚胎与所述胚胎保存液的体积比为1：（2～3）。
20、优选地，所述前处理为：将东风螺胚胎与明矾溶液混合，去除胚乳液后清洗。更具体而言，所述明矾溶液中，明矾的体积浓度为0.3～0.5%。专利技术人通过研究发现，当东风螺卵囊膜破开后，其中的胚乳液容易引起东风螺胚胎感染细菌，而采用明矾溶液可以起到去除胚乳液作用，进而降低东风螺胚胎的感染。
21、优选地，在一些具体实施方案中，所述逐级降温的操作为：
22、将东风螺胚胎与保存液的混合液依次在20℃、15℃、10℃、5℃、0℃阶段平衡5～6分钟，降温速度为3℃/分钟；
23、0～-60℃阶段，在-10℃、-20℃、-60℃三个时间点分别平衡7～12分钟，降温速度为2℃/分钟；
24、-60℃～-100℃阶段，在-80℃、-100℃两个时间点平衡10～15分钟，降温速度为1℃/分钟，待温度降至-100℃时，迅速将其放入液氮中保存。
25、优选地，所述东风螺胚胎为卵本文档来自技高网...
【技术保护点】
1. 一种胚胎保存液，其特征在于，以1L溶剂计，所述胚胎保存液包括：1.0～4.0g/L乙酰胺、0.01～0.04g/L N-乙酰半胱氨酸、0.04～0.06g/L聚乙烯醇、0.02～0.06g/L抑菌剂、0.3～0.6g/L缓冲剂、15～30g/L碳源。
2.根据权利要求1所述胚胎保存液，其特征在于，所述抑菌剂选自恩诺沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述胚胎保存液，其特征在于，所述缓冲剂选自磷酸二氢钾、碳酸二氢钠、碳酸二氢钾中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述胚胎保存液，其特征在于，所述碳源选自海藻糖、葡萄糖、果糖中的一种或多种。
5.权利要求1～4任一项所述胚胎保存液的制备方法，其特征在于，将乙酰胺、N-乙酰半胱氨酸、聚乙烯醇、抑菌剂、缓冲剂、碳源、溶剂混合，搅拌均匀，获得所述胚胎保存液。
6.权利要求1～4任一项所述胚胎保存液在东风螺胚胎冷冻保存中的应用。
7.一种东风螺胚胎的冷冻保存方法，其特征在于，将东风螺胚胎进行前处理去除胚乳液，随后采用权利要求1～4任一项所述胚
8.根据权利要求7所述冷冻保存方法，其特征在于，东风螺胚胎与所述胚胎保存液的体积比为1：（2～3）。
9.根据权利要求7所述冷冻保存方法，其特征在于，所述前处理为：将东风螺胚胎与明矾溶液混合，去除胚乳液后清洗。
10.根据权利要求7所述冷冻保存方法，其特征在于，所述逐级降温的操作为：
...【技术特征摘要】
1. 一种胚胎保存液，其特征在于，以1l溶剂计，所述胚胎保存液包括：1.0～4.0g/l乙酰胺、0.01～0.04g/l n-乙酰半胱氨酸、0.04～0.06g/l聚乙烯醇、0.02～0.06g/l抑菌剂、0.3～0.6g/l缓冲剂、15～30g/l碳源。
2.根据权利要求1所述胚胎保存液，其特征在于，所述抑菌剂选自恩诺沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述胚胎保存液，其特征在于，所述缓冲剂选自磷酸二氢钾、碳酸二氢钠、碳酸二氢钾中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述胚胎保存液，其特征在于，所述碳源选自海藻糖、葡萄糖、果糖中的一种或多种。
5.权利要求1～4任一项所述胚胎保存液的制备方法，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：吕文刚，刘晓坤，岳晨阳，朱晓闻，邓岳文，赵立强，郭慧，潘尚锋，陈景雷，
申请(专利权)人：广东海洋大学，
类型：发明
国别省市：
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