【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物分析检测，尤其是指一种基于金属荧光增强效应检测线粒体内一氧化氮的比率荧光方法。
技术介绍
1、一氧化氮(no)是一种重要的气体信使分子，通过内源性l-精氨酸在细胞中由一氧化氮合酶(nos)的作用下产生。no在各种生化过程中起着关键作用，如血管舒张、血压调节、神经保护和抑制炎症。机体内no水平异常与多种疾病密切相关，包括心血管系统疾病、中枢神经系统疾病和癌症。然而，由于其在生物系统中浓度低、半衰期短且容易被氧化，详细了解no的多重功能仍然是一个巨大的挑战。因此，迫切需要开发敏感准确的no检测方法，以更好地阐明其在生理和病理过程中的作用。线粒体是哺乳动物细胞中产生no的主要亚细胞器。最近的研究表明，no对线粒体功能具有精细调节作用，如调节线粒体呼吸链、调节线粒体膜电位和调节线粒体氧化应激反应。这些线粒体功能对于维持正常细胞功能和生存至关重要。因此，检测线粒体中no的水平对于揭示机体的生理和病理状态具有重要意义，为疾病的预防、诊断和治疗提供了新的方向和方法。
2、与其他一氧化氮检测方法(如比色法、电化学、化学发光和表面增强拉曼光谱)相比，荧光成像具有许多优点，包括其敏感性、特异性、实时非破坏性和多通道成像能力。然而，大多数荧光生物传感器仅专注于检测溶液系统或细胞中的no，无法实现对亚细胞器中no水平的监测和成像。
3、金属增强荧光(mef)效应是一种贵金属纳米材料(nmns)与附近荧光物质之间的等离子耦合现象。mef可以有效增强荧光物质的信号强度，其需要两个关键条件：nmns的吸收光谱与荧光物
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种基于金属荧光增强效应检测线粒体内一氧化氮的比率荧光方法，其具有高特异性靶向功能以及出色的成像检测能力，同时具有高灵敏、高特异性、测定准确等优点。
2、本专利技术通过以下技术方案实现：
3、本专利技术第一个目的是提供一种基于金属荧光增强效应检测线粒体内一氧化氮的比率荧光方法，包括以下步骤：
4、(1)将金纳米颗粒与ssdna通过金硫键连接，形成gnp-ssdna；
5、(2)将步骤(1)所得gnp-ssdna与修饰有荧光基团的cdna碱基互补配对，形成gnp-dsdna；所述荧光基团修饰在cdna的5ˋ端。
6、(3)通过点击化学反应将步骤(2)所得gnp-dsdna与响应探针pno520连接，形成gnp-pno520；
7、(4)将线粒体靶向肽修饰到步骤(3)所得gnp-pno520中的gnp表面，形成生物传感器mito-gnp-pno520；
8、(5)将所得生物传感器mito-gnp-pno520与细胞结合，通过对细胞内的生物传感器mito-gnp-pno520进行共聚焦荧光成像，检测荧光强度的变化，实现线粒体内一氧化氮的定量分析。
9、在本专利技术的一个实施例中，步骤(1)中，所述ssdna的核苷酸序列为：hs-sh c6-5ˋ-gcggctgttaagcataatatt-3ˋ-azide(n3)。
10、在本专利技术的一个实施例中，步骤(2)中，所述cdna的核苷酸序列为5ˋ-aatattatgcttaacagccgc-3ˋ。
11、在本专利技术的一个实施例中，步骤(2)中，所述荧光基团选自cy5、cy5.5、cy7、rox和alexa fluor 680中的一种或多种。
12、在本专利技术的一个实施例中，步骤(3)中，所述响应探针pno520通过以下方法制备得到：
13、将丙炔胺与4-溴-1,8-萘酮加入到醇溶液中，在惰性氛围下加热回流，得到的中间化合物；
14、将所得中间化合物、邻苯二胺和催化剂溶于有机溶剂中，在惰性氛围下混合反应，纯化后，得到响应探针pno520；所述催化剂选自碳酸钾与乙酸钯。
15、在本专利技术的一个实施例中，步骤(3)中，所述gnp-dsdna与响应探针pno520连接具体为：将pno520和催化剂添加到gnp-dsdna溶液中，避光孵育，得到gnp-pno520；所述催化剂为cu2+和抗坏血酸，所述催化剂
16、(cu2+和抗坏血酸)能催化pno520的炔基与dna上修饰的n3反应，从而使得pno520与gnp-dsdna连接在一起形成gnp-pno520。
17、在本专利技术的一个实施例中，步骤(4)中，所述线粒体靶向肽的氨基酸序列为：
18、met-leu-ala-leu-leu-gly-trp-trp-trp-phe-phe-ser-arg-lys-lys-cys。
19、在本专利技术的一个实施例中，步骤(5)中，所述细胞选自小鼠单核巨噬细胞白血病细胞、宫颈癌细胞(hela)、肝癌细胞(hepg2)和人肺腺癌细胞(a549)中的一种或多种。
20、在本专利技术的一个实施例中，步骤(5)中，所述结合的条件为：37℃孵育5min-30min。
21、在本专利技术的一个实施例中，步骤(5)中，所述一氧化氮的浓度为0.1nm-150nm。
22、本专利技术首先设计并合成了一氧化氮(no)响应探针pno520，然后定向制备了与pno520有光谱重叠的金纳米颗粒(gnp)，二者通过带有cy5荧光基团的双链脱氧核糖核酸(dsdna)连接，并通过调节dsdna的碱基数目来控制二者之间的距离以保证产生最佳的mef效应。最后将具有靶向线粒体功能的靶向肽(mls)修饰到gnp表面形成生物传感器mito-gnp-dna-pno520。在no存在的有氧条件下，pno520会与no发生反应生成no520而使其发生荧光恢复，并且在gnp的mef效应的作用下其荧光强度大大增强，而内参基团cy5的荧光强度则不发生变化，从而可以根据no520与cy5的荧光强度比值f520/f670与no浓度的线性关系计算出样品中no的含量。同时，该传感器可以特异性靶向线粒体对其内部的no进行检测以及成像研究。
23、本专利技术的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
24、本专利技术提供了一种基于金属荧光增强效应检测线粒体内一氧化氮的比率荧光方法；本专利技术设计并制备了no响应探针pno520，通过其与no的特异性反应产生荧光信号的变化，并且利用gnp与pno520之间的mef效应大大增强荧光信号，同时利用cy5荧光基团作为内参以比率荧光的方式检测no。由于靶向肽的存在，该方法可以特异性靶向线粒体检测并成像no。相对于传统检测方法，本专利技术具有高特异性、高灵敏度、特异性靶向细胞器、无损实时成像的优点。
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1.一种基于金属荧光增强效应检测线粒体内一氧化氮的比率荧光方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的比率荧光方法，其特征在于，步骤(1)中，所述ssDNA的核苷酸序列为：HS-SH C6-5`-GCGGCTGTTAAGCATAATATT-3`-Azide(N3)。
3.根据权利要求1所述的比率荧光方法，其特征在于，步骤(2)中，所述cDNA的核苷酸序列为5`-AATATTATGCTTAACAGCCGC-3`。
4.根据权利要求1所述的比率荧光方法，其特征在于，步骤(2)中，所述荧光基团选自Cy5、Cy5.5、Cy7、ROX和AlexaFluor 680中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的比率荧光方法，其特征在于，步骤(3)中，所述响应探针pNO520通过以下方法制备得到：
6.根据权利要求1所述的比率荧光方法，其特征在于，步骤(3)中，所述GNP-dsDNA与响应探针pNO520连接具体为：将pNO520和催化剂添加到GNP-dsDNA溶液中，避光孵育，得到GNP-pNO520；所述催化剂为Cu2+
7.根据权利要求1所述的比率荧光方法，其特征在于，步骤(4)中，所述线粒体靶向肽的氨基酸序列为：
8.根据权利要求1所述的比率荧光方法，其特征在于，步骤(5)中，所述细胞选自小鼠单核巨噬细胞白血病细胞、宫颈癌细胞、肝癌细胞和人肺腺癌细胞中的一种或多种。
9.根据权利要求1所述的比率荧光方法，其特征在于，步骤(5)中，所述结合的条件为：37℃孵育5min-30min。
10.根据权利要求1所述的比率荧光方法，其特征在于，步骤(5)中，所述一氧化氮的浓度为0.1nM-150nM。
...【技术特征摘要】
1.一种基于金属荧光增强效应检测线粒体内一氧化氮的比率荧光方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的比率荧光方法，其特征在于，步骤(1)中，所述ssdna的核苷酸序列为：hs-sh c6-5`-gcggctgttaagcataatatt-3`-azide(n3)。
3.根据权利要求1所述的比率荧光方法，其特征在于，步骤(2)中，所述cdna的核苷酸序列为5`-aatattatgcttaacagccgc-3`。
4.根据权利要求1所述的比率荧光方法，其特征在于，步骤(2)中，所述荧光基团选自cy5、cy5.5、cy7、rox和alexafluor 680中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的比率荧光方法，其特征在于，步骤(3)中，所述响应探针pno520通过以下方法制备得到：
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