本发明专利技术公开了一种猪蛔虫雌性成虫特异性表达的ｍｉＲＮＡ及其应用。本发明专利技术猪蛔虫雌性成虫特异性表达的ｍｉＲＮＡ序列为ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：１～８４所示的ｍｉＲＮＡ序列或与其互补的ｍｉＲＮＡ序列。本发明专利技术猪蛔虫雌性成虫特异性表达的ｍｉＲＮＡ只在猪蛔虫雌性成虫中表达，具有性别差异的特性，可用于影响雌性猪蛔虫生理功能或与性别发育、分化相关的功能，还可用于影响人蛔虫生理功能或与性别发育、分化相关的功能，用于制备蛔虫疫苗，为防治蛔虫病提供了新的途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及寄生虫学和生物
，具体涉及一种猪蛔虫雌性成虫特异性表达 的miRNA及其应用。
技术介绍
猪蛔虫(Ascaris suum)是猪体内最常见的寄生虫之一。猪蛔虫病流行广泛，是危 害广、造成严重经济损失、呈全球性分布的一大类寄生虫，对养殖业危害尤为严重。虽然猪 蛔虫感染通常并不致命，但由此导致的饲养猪营养不良及幼龄猪发育不良给农业和畜牧业 造成巨大经济损失。而长期过度的使用抗蠕虫药物已造成呈全球性分布的寄生虫抗药性问 题以及动物产品及环境中的药物残留问题。因此，加快对猪蛔虫的研究、寻找有效防治猪蛔 虫的新途径已经迫在眉睫。miRNA是一类内源性的非编码小RNA，广泛存在于真核生物中，具有发育阶段的特 异性、时序性或者组织特异性的表达特点，其功能主要为从转录后调控的水平调节个体生 长及发育相关基因表达。研究业已表明，寄生线虫存在独特的miRNA转录后调控机制，它们 可以通过miRNA实现对宿主和自身基因表达模式的精确调控，从而提高感染和自身增殖的 几率并逃避免疫监视。通过选择性地抑制或阻断某一特定发育期线虫的发育，从而减少或 阻断寄生线虫的传播很可能是防治线虫感染的新思路、新途径。猪蛔虫物种特异性miRNA 有可能成为猪蛔虫免疫预防或化学防治的新的“关键”分子，为核酸疫苗制备提供基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于根据现有的抗蠕虫药物造成的寄生虫抗药性问题，以及动物产 品和环境中的药物残留问题，提供一种猪蛔虫雌性成虫特异性表达的miRNA。本专利技术另一目的在于提供上述猪蛔虫雌性成虫特异性表达miRNA的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案予以实现一种猪蛔虫雌性成虫特异性表达的miRNA，其核苷酸序列如下(1)如 SEQ ID NO :1 84 所示；(2)与SEQ ID NO :1 84中的任何一条序列互补的序列。其中，所述互补的序列为DNA或RNA。作为一种优选方案，所述互补的序列为经过修饰的DNA或RNA，如硫代修饰或甲氧基修饰。据此，本专利技术所提供的猪蛔虫雌性特异性miRNA均克隆自猪蛔虫成虫，成熟的 miRNA序列长度为18 25nt。对猪蛔虫雌虫和雄虫miRNA进行深度测序，获得两种成虫的 miRNA表达谱，通过比对发现，SEQ ID NO :1 84所示的miRNA只在雌性成虫中表达，而在 雄性成虫中不表达；对随机选择的5种miRNA(SEQID NO :3、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :28、 SEQ ID N0:48及SEQ ID NO 84)进行的荧光定量PCR分析亦表明，本专利技术所述的miRNA只 在雌虫中表达，表明本专利技术所述的miRNA具有性别差异的特性。因此，在猪蛔虫体内过表达3SEQ IDNO :1 84分子或采用所述miRNA的反向互补序列抑制SEQ ID NO :1 84的表达 将影响雌性猪蛔虫生理功能及与性别发育或性别分化相关的功能。此外，鉴于猪蛔虫和人 蛔虫的物种相似性，本专利技术所提供的猪蛔虫雌性特异性miRNA前体及其反向互补序列亦可 应用于影响人蛔虫生理功能及与性别发育或性别分化相关的功能。因此，本专利技术猪蛔虫雌 性成虫特异性表达的miRNA可用于制备蛔虫疫苗，特别是猪蛔虫疫苗或人蛔虫疫苗。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果本专利技术猪蛔虫雌性成虫特异性表达的miRNA可以选择性的抑制或阻断某一特定 发育期线虫的发育，从而减少或阻断寄生虫，尤其是蛔虫的传播。本专利技术miRNA制备成为蛔 虫疫苗时，作为核酸疫苗，避免了传统抗蠕虫药物造成的全球性分布的寄生虫抗药性问题， 也不会导致动物产品或环境中药物残留。具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。实施例ImiRNA的获得1.总 RNA 抽提1)猪蛔虫雌虫和雄虫成虫整体称重，分别用液氮研磨组织至粉末，加入lOOmg/mL 加入Trizol (Invitrogen)溶液，吹打混勻，使组织充分裂解，静置5min ；取裂解液Iml加入 200 μ 1氯仿，剧烈振荡混勻30s，使水相和有机相充分接触，室温静置15min ；2)41下，10，00(^离心151^11，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的 RNase free EP 管；3)沉淀RNA 加入0. 5ml异丙醇，轻柔地充分混勻，室温静置IOmin ；4) 4°C下，10，OOOg离心lOmin，收集RNA沉淀，去上清；用75%乙醇洗涤两次，超净 台风干；5)加入15 60 μ 1 DEPC水溶解沉淀。2.总RNA纯度和完整性检测纯度检测取1 μ 1 RNA样品50倍稀释，在BioPhotometer plus核酸蛋白测定仪 上测定OD值，0D260/0D280的比值大于1. 8。总RNA完整性检测取RNA样品1 μ 1，1 %琼脂糖凝胶电泳80VX 20min，用凝胶成 像系统观察总RNA的5s rRNA, 18s rRNA和28s rRNA条带，三条条带完整。3. small RNA序列的获得和筛选用15% PAGE 胶回收 20 30nt 的 small RNA，加上 5'和 3'接头(购自 Illumina 公司)后实施RT-PCR (反转录试剂盒购自Invitrogen公司)。产物经6% TBE PAGE胶纯 化后进行Solexa测序。屏蔽掉可能为接头序列的部分、测序质量差的序列(例如测序信号 很低等)及长度小于18nt的序列获得clean reads。4. miRNA 的鉴定M BLAST 禾呈· (NCBI,www. ncbi. nlm. nih. gov/Blast) M clean reads 与 GenBank 禾口 Rfam database (version 9. 0) (http://www. Sanger, ac. uk/software/Rfam/mima)进行 比对分析，去除非编码RNA序列，包括rRNA，tRNA, snRNA, snoRNA和其它非编码RNA ；通过4RepeatMasker (http //www. repeatmasker. org)去除转座子等重复序列；然后搜索 Sanger miRBase (version 13. 0)数据库，寻找序列相似性miRNA。搜索条件为错配数小于2，获得与 已知数据库miRNA具有序列相似性的miRNA。将雌虫表达的miRNA与雄虫进行比较，屏蔽 掉雌虫中与雄虫相同的序列，获得雌性成虫特有的miRNA。共获得84条猪蛔虫雌性特异性 miRNA (如 SEQ ID NO 1 84 所示)。实施例2荧光定量PCR分析对随机选择的5 种 miRNA，包括 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :9、SEQ IDNO 28、SEQ ID NO 48及SEQ ID NO 84进行实时荧光定量PCR分析。反应体系如下cDNA(l 20)5. 0 μ 1上游引物0·5μ1下游引物0·5μ12x SYBR Green PCR Master 10 μ 1MixH20总体积 反应条件如下65°C 30s - 72°C 32s 读板；融解曲线分析温度60°C -95°C。每个样重复3次。定量PCR 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪蛔虫雌性成虫特异性表达的ｍｉＲＮＡ，其核苷酸序列为ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１～８４所示的ｍｉＲＮＡ序列或与其互补的序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林瑞庆，徐民俊，袁子国，宋慧群，朱兴全，贺现辉，颜超，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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