【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病原鉴定，尤其涉及花椒黄花病病原鉴定方法。
技术介绍
1、花椒是一种常见的中药配料、香料和调味料，在中国、东南亚和日本有着广阔的市场。重庆因地理、气候优势，成为青花椒的重点优势产区，其中，素有“花椒之乡”称谓的江津，拥有全国最大的优质青花椒生产基地53万亩，其主产的九叶青花椒，更是长期占据全国青花椒市场的主导地位。然而在花椒产业逐渐扩大做强的同时，一些影响花椒产量的病害却无法得到有效防控，表现较为突出的就有花椒黄花病。
2、花椒黄花病是一种因花椒受线虫传播病毒影响而引起的花椒生理代谢失调、花器官发育混乱而发生的生理性病害，在重庆市青花椒基地内5年前开始出现的这一病症，一旦开花就丧失结果能力，直至死亡，所以黄花病又被称为是“花椒癌症”。具体表现为花的雄蕊异常分化明显，雌蕊退化短小，与正常花椒孤雌生殖仅有雌蕊发育，雄蕊败育的花形状完全不一样，而且开黄花的花椒开花前后叶片皱缩、节间短缩，初步分析为花椒内缘激素失衡，雌花不能发育，造成花椒树不结果或少结果，严重影响花椒产业健康发展。
3、但是现有技术中没有对花椒黄花病病原的鉴定方法，从而影响花椒黄花病的后续治理效果。
技术实现思路
1、1.要解决的技术问题
2、本专利技术的目的是为了解决现有技术中花椒黄花病病原的鉴定方法较为简单，无法准确全面的对花椒黄花病病原进行鉴定的问题，而提出的花椒黄花病病原鉴定方法。
3、2.技术方案
4、为了实现上述目的，本专利技术采用了如下
5、花椒黄花病病原鉴定方法，包括以下步骤：
6、步骤1：引物设计：使用dnaman7设计gspnev rna1、gspiv、gspev(genbankno.mh323436.1)、gspnuv、gspvcav和satgspnev这五种病毒和卫星病毒的特异性引物，内参引物根据genbank中报道的花椒的部分its2序列genbank no.kx192307.1设计；
7、步骤2：rna的提取和cdna的合成：采用ctab法提取植物rna，将0.1g叶组织在液氮中充分研磨，并用1ml 2％的ctab缓冲液2％ctab、4％pvp-40、100mm的tris-hcl ph 8.0、25mm的edta ph8.0、2m的nacl和1％的β-巯基乙醇提取，涡旋，并在65℃下孵育20分钟；在12000g离心15分钟后，将上清液转移到新鲜离心管中，加入等体积的氯仿，涡旋，并在室温下孵育3分钟；在12000g离心15分钟后，转移上清液并与上清液体积的1/3的licl 8m混合以沉淀rna；将混合物在-80℃下保持30分钟或-20℃过夜，并以12000g离心20分钟，将沉淀颗粒用75％乙醇洗涤两次，并溶解在不含rnase的水中；
8、步骤3：pcr检测体系：以cdna为模板，使用病毒的特异性引物对青花椒样品进行pcr扩增；pcr程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存；待pcr扩增结束后，使用2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，上样5μl，最后使用凝胶成像仪观测并记录结果；
9、步骤4：高通量测序：从采集的青花椒样品中选择dx-1/4/8作为带毒样品和三株健康植株作为对照植株；样品使用标准提取方法提取rna，按照neb普通建库方式或链特异性建库方式对质控合格的rna进行建库，库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行illumina测序。
10、优选地，所述步骤1中五种病毒和卫星病毒为genbank中报道的genbankno.mh323435.1、genbank no.mh323432.1、genbank no.mh323436.1、genbankno.mh323437.1、genbank no.mk371353.1和genbank no.mw962342.1。
11、优选地，所述步骤2中使用nanodrop 2000分光光度计thermo fisherscientific，waltham，ma，usa和电泳来估计rna浓度和质量。
12、优选地，所述步骤2中对于cdna合成，反应体系为1μg来自叶组织的总rna、4μl 5×m-mlv反应缓冲液、1μl随机引物、2μl 2.5mm dntp、1μl rnase抑制剂(40单位/μl)和1μl m-mlv逆转录酶(100单位/μl)，在42℃下孵育60分钟，然后在70℃下孵育5分钟。
13、优选地，所述步骤3中pcr体系如下：2×taq mix 7.5μl、上下游引物各0.4μl(10μmol/l)，模板1.0μl，使用ddh2o补至15μl。
14、优选地，所述步骤4中样品叶片和花分别由北京诺禾致源生物科技有限公司使用illumina测序方法对处理后的rna进行测序。
15、3.有益效果
16、相比于现有技术，本专利技术的优点在于：
17、本专利技术中，通过引物设计、rna的提取和cdna的合成等鉴定步骤的设计，可以准确全面的对花椒黄花病病原进行鉴定，从而有效提升了花椒黄花病的后续治理效果。
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1.花椒黄花病病原鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的花椒黄花病病原鉴定方法，其特征在于，所述步骤1中五种病毒和卫星病毒为GenBank中报道的GenBankno.MH323435.1、GenBank no.MH323432.1、GenBank no.MH323436.1、GenBank no.MH323437.1、GenBank no.MK371353.1和GenBankno.MW962342.1。
3.根据权利要求1所述的花椒黄花病病原鉴定方法，其特征在于，所述步骤2中使用Nanodrop 2000分光光度计Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA和电泳来估计RNA浓度和质量。
4.根据权利要求1所述的花椒黄花病病原鉴定方法，其特征在于，所述步骤2中对于cDNA合成，反应体系为1μg来自叶组织的总RNA、4μl 5×M-MLV反应缓冲液、1μl随机引物、2μl 2.5mM dNTP、1μl RNase抑制剂(40单位/μl)和1μl M-MLV逆转录酶(100单位/μl)，在4
5.根据权利要求1所述的花椒黄花病病原鉴定方法，其特征在于，所述步骤3中PCR体系如下：2×Taq Mix 7.5μl、上下游引物各0.4μl(10μmol/L)，模板1.0μl，使用ddH2O补至15μl。
6.根据权利要求1所述的花椒黄花病病原鉴定方法，其特征在于，所述步骤4中样品叶片和花使用Illumina测序方法对处理后的RNA进行测序。
...【技术特征摘要】
1.花椒黄花病病原鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的花椒黄花病病原鉴定方法，其特征在于，所述步骤1中五种病毒和卫星病毒为genbank中报道的genbankno.mh323435.1、genbank no.mh323432.1、genbank no.mh323436.1、genbank no.mh323437.1、genbank no.mk371353.1和genbankno.mw962342.1。
3.根据权利要求1所述的花椒黄花病病原鉴定方法，其特征在于，所述步骤2中使用nanodrop 2000分光光度计thermo fisher scientific，waltham，ma，usa和电泳来估计rna浓度和质量。
4.根据权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：程玥晴，吴纯清，谢永红，张义刚，罗友进，
申请(专利权)人：重庆市农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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