产生大量存活的棉花植物的体外组织培养方法技术

本发明专利技术涉及从特定棉花植物的组织产生大量可存活棉花植物的体外组织培养方法。发明专利技术提供了不依赖基因型、直接的、复技繁殖的方法，并提供了微繁殖、突变体的选择以及用农业生物技术和基因工程的现代方法产生基因改良的棉花植物开创了新的可能性。本发明专利技术的方案提供了用组织培养技术使棉花成功改良的重要步骤。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及从特定的棉花植物中产生出大量存活的棉花植物的体外组织培养方法。本专利技术提供了基因型非依赖的、直接的、复枝的增生，并为微繁殖、突变体的选择和通过农业生物技术和基因工程的现代方法产生基因改良的棉花植物开创了新的可能性。该方案提供了用组织培养技术使棉花成功改良的重要步骤。棉花是全球重要的作物，最初用作纤维。棉籽是家畜重要的食物来源。棉花影响着许多国家，直至全世界的经济发展。因此，全世界都对用现代农业生物技术方法改良棉花的计划有着深厚的兴趣。这增加了对棉花用基因工程的现代技术开发组织培养方法的重要性。已公开了一些棉花的组织培养方法。它们涉及通过悬浮液和愈伤组织培养物的直接的枝条分化和体细胞的胚胎发生。下面列出这些文献供参考。在多个植物种，如菜豆(Phaseolus sp.)中已显示了器官发生和再生，通过组织培养方法得到微繁殖。(Rubluo A & Kartha KK 1985”In vitro cultrue of shootapicalmeristems of various Phaseolus species and cultivars”J.of Plant physiol119425-433)，Glycine max(Shetty K.，Asano Y和Oosawa K 1992“stimulation of invitro shoot organogenesis in Glycine max Merrill by allantoin and amides”PlantSci.8l245-252)，Cajanus cajan(Shiv Prakash N，Pental D & Bhalla-Sarin N 1994“Regeneration of pigeonpea from cotyledonary node via multiple shootformation”Plant Cell Rep.13623-622)，Carnation(ClaireAnnev A.Yancheva S和DonsH 1995”Cells with in the nodal region of carnation shoots exhibit a high potential foradventitious shoot formation.”Plant Cell Tiss.Org.Cult.40151-157)等。已经完全建立了用组织培养技术进行植物再生。已成功地通过器官发生或形成体细胞胚胎发生在体外使各种植物种再生。器官发生形成了器官，即茎(或根)，它们可分别诱导根(或茎)的形成以产生整个植物，而体细胞胚胎发生导致形成体细胞的胚(无需受精即形成胚)，它开始可同时发芽和出根，并能长成整个植株。虽然植株各个部分和细胞能再生成整个植株(称为全能性)是公知的现象，但每个植物或每个植物部分需要特定的研究以得到允许这类再生的条件。现已测定了一些控制这类培养物生长和分化的广泛适用的因子。建立不同组植物激素和生长调节剂之间单独的相互作用或结合的相互作用是对存在于细胞、组织和器官中某些关系的反应。人们现已达成共识成功地引发分化取决于外植体的种类、外植体的生理条件和在培养时外植体的物理和化学环境。由于这个因素，组织培养学科涉及到优化源植物的生理条件、外植体的种类、培养条件和用来激发组织培养的植物激素。这表明开发通过组织培养使植物增殖的新方法是非显而易见的。本专利技术的一个主要方面逐个研究引发再生的植物生长调节剂的种类和用量。此外，培养基的化学组合物、生长温度和其它培养条件在引发器官发生和体细胞胚胎发生、以及茎和根的成熟和形成正常结实的植株中都起着重要的作用。对培养基、激素和生长条件的反应各个植物种类不尽相同。因此，对于给定的植物，其植物有效的再生、器官发生和体细胞胚胎发生需要开创性的特殊知识。另一个主要领域是组织培养需要革新，它可识别足以对培养条件反应并得到繁殖的植物部分。不是所有给定植物部分都能有效地再生的。这是具有全能性的植物部分(称为外植体)、外植体的生理状况和生长条件，特别是决定组织培养中植物成功的生长调节剂的复杂的结合。来自给定植物不同外植体通常对增殖的生长条件有很不同的反应，没有通则可用以实现再生。在每种情况下，外植体和培养条件的确定是将植物部分再生成许多植物或体细胞胚的组织培养方法中的革新步骤。对从培育的棉花变异体的任何组织外植体来形成复枝尚没有新的、详细的公开物。本专利技术首次揭示了从棉花秧苗的小部分(称为外植体)通过组织培养得到棉花植物多枝的器官发生方案。该方法在显微繁殖和基因转化的农业生物技术中极为有用，因为它显示对经专利技术者试验的所有培养物都适用，且枝可有效地成熟。该方法在用农业生物技术的现代方法改良棉花的计划中很有潜力。一些文献涉及使体细胞胚(不经受精而得到正常植物的结构)生长的组织培养条件(Davidonis GH和Hamilton RH，1983从棉花愈伤组织中再生植物(Plantregeneration from callus tissue of Gossypium hirsutum L.)Plant Sci.Lett.3289-93；Shoemarker RC，Couche LJ & Galbraith DW 1986；棉花(Gossypium hirsutum L)中体细胞胚胎发生和植物再生的特征(Characterization of somatic embryogenesisand plant regeneration in cotton)Plant Cell Rep.3178-181；Trolinder NL和Goodin JR1987；棉花中体细胞胚胎发生和植物再生(Somatic embryogenesis and plantregeneration in cotton Gossypium hirsuturn L.)Plant Cell Rep.6231-234 Finer J.1988.来自棉花的体细胞胚胎发生悬浮液培养物的植物再生(Plant regeneration fromsomatic embryogenesis suspension cultures of cotton Gossypium hirsutum.)Plant CellRep.7399-402)。体细胞胚的引发和成熟在数月内发生。该方法高度依赖于基因型(Trolinder NL和Xhixian C.1989棉花中体细胞胚发的反应的基因型特异性(Genotype specificity of the somatic embryogenesis response in cotton)Plant Cell Rep.8133-136)，因此适用于限定的变种。体细胞胚的引发和成熟在数月内发生，据报道通过体细胞胚胎发生的再生植物在细胞学和形态学上是异常的(Stelly DM，Altman DW，Kohel Rz，Rangan TS & Commeskey E 1989，来自愈伤组织培养物的棉花体细胞克隆的细胞遗传学异常(Cytogenetic abnormal本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过组织培养技术从带有或不带有一片或部分子叶的棉花秧苗的子叶结（也称为子叶轴或腋）开始再生大量存活的和可育的棉花植物，所述的方法包括：（ｉ）用常规的方法处理棉花植物的种子以除去细菌／真菌（污染物），（ｉｉ）在ｐＨ５．４－６．２范围里，在由下列物质构成的第一培养基中培养步骤（ｉ）所得的处理过的种子进行发芽：ａ．任何常规培养基的盐，ｂ．任何常规培养基的维生素，ｃ．碳来源，和ｄ．凝胶剂培养基通过压热器消毒，培养在光存在下（至少４０微摩尔／米↑［２］秒）于２０－４０℃温度下进行１６小时，持续３天到数周，（ｉｉｉ）切下从步骤（ｉｉ）所得的带有或不带有部分或完整子叶的子叶结（外植体），（ｉｖ）在ｐＨ５．４－６．２的范围里，在由下列物质构成的第二培养基中培养从步骤（ｉｉｉ）所得的外植体，以达到枝条繁殖：ａ．任何常规培养基的盐，ｂ．任何常规培养基的维生素，ｃ．碳源，ｄ．植物激素（植物生长调节剂），浓度范围为０．１－１００μＭ的诸如６－苄基氨基嘌呤、６－苄基腺嘌呤、γ，γ－二甲基烯丙基氨基嘌呤、激动素和细胞激动素活性脲衍生物的细胞激动素结合物，ｅ．凝胶剂培养基通过压热器消毒，培养在光存在下（至少４０微摩尔／米↑［２］秒）于２０－４０℃温度下进行１６小时；（ｖ）继续培养，最少达４周直至形成许多枝条；（ｖｉ）收获形成的枝条；（ｖｉ）在ｐＨ５．４－６．２范围里，将收获的枝条转移到包括下列物质的生根培养基（第三培养基）中：ａ．任何常规培养基的盐，ｂ．任何常规培养基的维生素，ｃ．碳源，ｄ．植物激素（植物生长调节剂），包括选自吲哚乙酸、吲哚丁酸和萘乙酸的植物生长素，ｅ．凝胶剂培养基通过压热器消毒，（ｖｉｉｉ）在温度２０－４０℃和光存在下（至少４０微摩尔／米↑［２］秒）培养１６小时，直至形成根。...

【技术特征摘要】
IN 1996-10-29 2334/Del/961.一种通过组织培养技术从带有或不带有一片或部分子叶的棉花秧苗的子叶结(也称为子叶轴或腋)开始再生大量存活的和可育的棉花植物，所述的方法包括(i)用常规的方法处理棉花植物的种子以除去细菌/真菌(污染物)，(ii)在pH5.4-6.2范围里，在由下列物质构成的第一培养基中培养步骤(i)所得的处理过的种子进行发芽a.任何常规培养基的盐，b.任何常规培养基的维生素，c.碳来源，和d.凝胶剂培养基通过压热器消毒，培养在光存在下(至少40微摩尔/米2秒)于20-40℃温度下进行16小时，持续3天到数周，(iii)切下从步骤(ii)所得的带有或不带有部分或完整子叶的子叶结(外植体)，(iv)在pH5.4-6.2的范围里，在由下列物质构成的第二培养基中培养从步骤(iii)所得的外植体，以达到枝条繁殖a.任何常规培养基的盐，b.任何常规培养基的维生素，c.碳源，d.植物激素(植物生长调节剂)，浓度范围为0.1-100μM的诸如6-苄基氨基嘌呤、6-苄基腺嘌呤、γ，γ-二甲基烯丙基氨基嘌呤、激动素和细胞激动素活性脲衍生物的细胞激动素结合物，e.凝胶剂培养基通过压热器消毒，培养在光存在下(至少40微摩尔/米2秒)于20-40℃温度下进行16小时；(v)继续培养，最少达4周直至形成许多枝条；(vi)收获形成的枝条；(vii)在pH5.4-6.2范围里，将收获的枝条转移到包括下列物质的生根培养基(第三培养基)中a.任何常规培养基的盐，b.任何常规培养基的维生素，c.碳源，d.植物激素(植物生长调节剂)，包括选自吲哚乙酸、吲哚丁酸和萘乙酸的植物生长素，e.凝胶剂培养基通过压热器消毒，(viii)在温度20-40℃和光存在下(至少40微摩尔/米2秒)培养16小时，直至形成根。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的第一、第二和第三培养基包括MS培养基的盐、B5培养基的维生素、碳源和凝胶剂。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述的第二和第三培养基包括MS培养基的盐、B5培养基的维生素、碳源、植物激素(植物生长调节剂)和凝胶剂。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的第一、第二和第三培养基包括下列MS培养基的盐组份 浓度(mg/L)a.MS培养基的盐NH4NO31650KNO31900MgSO4·7H2O370MnSO4·H2O 169ZnSO4·7H2O8...

【专利技术属性】
技术研发人员：拉克什，图里，阿洛克，库马，斯里瓦斯塔瓦，希夫，库马，古普塔，
申请(专利权)人：科学工业研究委员会，
类型：发明
国别省市：IN[印度]