【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】 参考引用本申请要求2004年6月4日提交的美国临时专利申请系列号60/576,771的权益。前述的申请和在其中或其审查期间引用的所有文件(“申请引用文件”)及所有在“申请引用文件”中引用或参考的文件和所有在这里引用或参考的文件(“此处引用的文件”)及所有在“此处引用的文件”中引用或参考的文件以及对这里或者在这里引作参考的任何文件所提到的任何产品的任何厂商的用法说明书、描述、产品规格和产品小册子，均在此引入作为参考，并可能在本专利技术的实施中使用。专利
本专利技术提供为猫科动物接种疫苗对抗猫白血病的方法。
技术介绍
FeLV是全世界常见的家猫感染，导致显著的发病率和死亡率。抗原血症的患病率可从在健康猫中的1-5％到在病猫中的15-30％而变化(Hosie M.J.等人，Veterinary Records，1989，128，293-297；Braley J.，Feline Practice，1994，22，25-29；Malik R.等人，Australian Veterinary Journal，1997，75，323-327；Arjona A.等人，Journ...
【技术保护点】
引发对抗ＦｅＬＶ的安全的和保护性的免疫应答的方法，包括将含有有效量的编码和表达至少一种ＦｅＬＶ免疫原的重组病毒载体和可接受的赋形剂或稀释剂的疫苗用喷液无针注射器给猫科动物施用。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2004-6-4 60/576,771和/或段落中，如“包含”等类似的术语可具有在美国专利法中归于其的含义，例如它们可能意味着“包括等类似含义；如“基本上由……组成”的术语具有在美国专利法中赋予其的含义，例如它们可允许未明确引述的成分，但排除在现有技术中发现的成分或影响本发明的基本特征或新特征的成分。这些和其它实施方案被公开或由下面的详细描述显而易见且包括在内。附图的简要描述下面以实例给出的详细描述，并非有意将本发明局限于所描述的特定实施方案，可以结合附图加以理解，将其引入作为参考，其中图1例示了使用无针注射器注射到猫的稀释的中国墨汁的分布情况。黑色箭头指示墨汁在真皮和皮下分布的区域。图2例示了使用无针注射器注射到猫的稀释的中国墨汁的分布情况。黑色箭头指示墨汁在真皮内分布的区域。详细描述本发明涉及针对FeLV的疫苗接种方法，包括使用喷液无针注射器将有效量的基于病毒载体的FeLV重组疫苗基本上施用于猫科动物的真皮和皮下的步骤，该施用引发针对FeLV的安全的和保护性的免疫应答。“基本上”意思是指有些疫苗也可能在表皮或肌肉中被发现。保护性免疫应答的特征为在攻击后抗原血症显著减轻或显著的中和抗体滴度。安全的免疫应答的特征是与疫苗施用相关的负作用的局限，尤其是局部注射部位反应的显著减轻或缺乏，以及疫苗施用后厌食和抑郁等症状的显著减轻或缺乏。猫科动物包括猫，这包括新生、幼崽、雄性、雌性、怀孕雌性。疫苗包含重组病毒载体和可接受的赋形剂或稀释剂。重组病毒载体特别包括疱疹病毒、腺病毒和诸如禽痘(US-A-5,174,993；US-A-5,505,941和US-A-5,766,599)或金丝雀痘等的痘病毒(US-A-5,756,103)。赋形剂或稀释剂包括但并不局限于无菌水、生理盐水、葡萄糖、缓冲液等类似液体。赋形剂或稀释剂还可包括多元醇、糖族或pH缓冲剂。赋形剂或稀释剂还可包括例如氨基酸、肽、抗氧化剂、杀菌剂、抑菌化合物。重组病毒载体编码并表达至少一种FeLV免疫原，尤其是FeLV env基因或FeLV env和gag/pro基因。FeLV基因组的完整序列可以在Chen等人，J Virol.1998 Sep；72(9)7048-56中找到，结合常规实验方法，可使本领域技术人员确定任何FeLV免疫原的序列。在这一实施方案的优选方面，本发明的方法是利用表达FeLV env或FeLV env和gag/pro基因的重组金丝雀痘病毒(如vCP97构建体，见US-A-5.756.103中的实施例53)来实施的。作为本发明的可选方面，本发明的方法利用表达FeLV env或FeLVenv和gag/pro基因的重组禽痘病毒来实施。本发明进一步包括至少一种FeLV免疫原，其包含于载体分子或表达载体中，与启动子元件及可选地与增强子可操作性连接。在一有利实施方案中，启动子为巨细胞病毒(CMV)即刻早期基因的启动子。在另一有利实施方案中，启动子和/或增强子为氧诱导型。可用于本发明方法的氧诱导型启动子和/或增强子的实例包括但不限于早期生长反应-1(Egr1)启动子(见例如Park等人，J Clin Invest.2002 Aug；110(3)403-1)，缺氧诱导因子(HIF)诱导型增强子(见例如Cuevas等人，Cancer Res.2003 Oct 15；63(20)6877-84)和Mn-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)启动子(见例如Gao等人，Gene.1996Oct 17；176(1-2)269-70)。在另一实施方案中，启动子和/或增强子包括多种细胞或组织特异性启动子(如肌肉、内皮细胞、肝、体细胞或干细胞)，多种病毒启动子和增强子，以及对各种动物物种等基因特异性的多种FeLV免疫原序列。已描述的肌肉特异性启动子和增强子的例子是本领域技术人员已知的(见例如Li等人，Gene Ther.1999 Dec；6(12)2005-11；Li等人，Nat Biotechnol.1999 Mar；17(3)241-5和Loirat等人，Virology.1999 Jul 20；260(1)74-83；其公开内容整体引作参考)。本发明中可使用的启动子和增强子包括但不限于劳斯肉瘤病毒的LTR、HSV-1的TK、SV40的早期或晚期启动子、腺病毒主要晚期(MLP)，磷酸甘油酸酯激酶、金属硫蛋白、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、胶原酶、弹性蛋白酶I、β-肌动蛋白、β-珠蛋白、γ-珠蛋白、α-胎蛋白、肌肉肌酸激酶。“载体”是指重组DNA或RNA质粒或病毒，其含有有待在体外或体内递送至靶细胞的异源多核苷酸。异源多核苷酸可以包含以治疗为目的的感兴趣基因序列，并可任选地为表达盒形式。正如在此处所用的，载体并不需要能够在最终的靶细胞或对象中复制。该术语包括克隆载体，病毒载体也包括在内。术语“重组”意为半合成或合成来源的多核苷酸，其不存在于自然界中或以自然界未发现的排列与另一多核苷酸连接。“异源”是指源自遗传上独特的实体，其不同于与之相比较的实体的其余部分。例如，多核苷酸可以通过基因工程技术置入得自另一不同来源的质粒或载体中，并称为异源多核苷酸。从它的天然编码序列中移出并有效连接到非天然序列的编码序列的启动子为异源启动子。本发明的多核苷酸可以包含额外序列，例如在同一转录单元中的附加编码序列，控制元件如启动子，核糖体结合位点，多聚腺苷酸位点，处于同一或不同启动子控制的其他转录单元，允许克隆、表达、同源重组和宿主细胞转化的序列，以及可能对于提供本发明实施方案理想的任何这类构建体。本发明包括表达FeLV免疫原或其变体或同源物或片段的载体。表达FeLV免疫原的元件有利地存在于本发明的载体中。最低限度地，这包含、基本上组成或组成为起始密码子(ATG)、终止密码子和启动子，以及任选地对某些载体如质粒和特定病毒载体如不是痘病毒的病毒载体还有多聚腺苷酸序列。当多核苷酸编码多蛋白片段如FeLV免疫原时，有利的是在载体中，ATG置于阅读框的5’端，终止密码子置于3’端。其他控制表达的元件也可存在，如增强子序列、稳定序列如内含子和使蛋白分泌的信号序列。制备和/或施用载体或重组体或质粒以在体内或体外表达本发明基因的基因产物的方法可以是任何期望的方法，例如可通过以下文件中公开的方法或以下文件中引述的文件中公开的方法或类似方法美国专利4,603,112；4,769,330；4,394,448；4,722,848；4,745,051；4,769,331；4,945,050；5,494,807；5,514,375；5,744,140；5,744,141；5,756,103；5,762,938；5,766,599；5,990,091；5,174,993；5,505,941；5,338,683；5,494,807；5,591,639；5,589,466；5,677,178；5,591,439；5,552,143；5,580,859；6,130,066；6,004,777；6,130,066；6,497,883；6,464,984；6,451,770；6,391,314；6,387,376；6,376,473；6,368,603；6,348,196；6,306,400；6,228,846；6,221,362；6,217,883；6,207,166；6,207,165；6,159,477；6,153,199；6,090,393；6,074,649；6,045,803；6,033,670；6,485,729；6,103,526；6,224,882；6,312,682；6,348,450和6；312,683；美国专利申请系列号920,197，申请日为1986年10月16日；WO 90/01543；WO 91/11525；WO 94/16716；WO 96/39491；WO 98/33510；EP 265785；EP 0 370 573；Andreansky等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996；9311313-11318；Ballay等人，EMBO J.1993；43861-65；Felgner等人，J.Biol.Chem.1994；2692550-2561；Frolov等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996；9311371-11377；Graham，Tibtech1990；885-87；Grunhaus等人，Sem.Virol.1992；3237-52；Ju等人，Diabetologia 1998；41736-739；Kitson等人，J.Virol.1991；653068-3075；McClements等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996；9311414-11420；Moss，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996；9311341-11348；Paoletti，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996；9311349-11353；Pennock等人，Mol.Cell.Biol.1984；4399-406；Richardson(Ed)，Methods in Molecular Biology1995；39，“Baculovirus Expression Protocols，”Humana PressInc.；Smith等人(1983)Mol.Cell.Biol.1983；32156-2165；Robertson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996；9311334-11340；Robinson等人，Sem.Imm unol.1997；9271；和Roizman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996；9311307-11312。由此，本发明中的载体可以是任意合适的重组病毒或病毒载体，例如痘病毒(如痘苗病毒、鸟痘病毒、金丝雀痘病毒、禽痘病毒、浣熊痘病毒、猪痘病毒等)，腺病毒(如人腺病毒、犬腺病毒)，疱疹病毒(如犬疱疹病毒)，杆状病毒，逆转录病毒等(如本文引作参考的文件中)；或载体可为质粒。这里引用或引入作为参考的文件，除了提供在本发明实施中有用的载体实例外，还可以提供诸如非-FeLV免疫原、非-FeLV抗原肽或其片段和细胞因子等的非-FeLV免疫原的来源，这些非-FeLV免疫原有待通过在本发明组合物中或其所包括在内的载体表达。本发明还涉及包含载体如表达载体的制剂，如治疗组合物。这种制剂可以包含、基本上组成或组成为一种或多种载体，如表达载体，例如体内表达载体，所述载体包含、基本上组成或组成为(并有利地表达)一种或多种FeLV免疫原。有利的是，这种载体包含并表达多核苷酸，该多核苷酸包括、基本上组成或组成为编码一种或多种FeLV免疫原的编码区；和药学或兽医学上可以接受的载体、赋形剂或介质。这样，根据本发明的一个实施方案，制剂中的另一载体或多种载体包含、基本上组成或组成为，编码FeLV免疫原或其片段的一种或多种其它蛋白的多核苷酸，并在适宜的情况下所述载体表达所述蛋白。根据本发明的另一实施方案，制剂中的一种或多种载体包含、基本上组成或组成为，编码FeLV免疫原的一种或多种蛋白或其片段的多核苷酸，所述载体具有所述多核苷酸的表达。本发明的制剂有利地包含、基本上组成或组成为至少两种载体，其包含、基本上组成或组成为，来自不同FeLV分离株的编码相同蛋白和/或不同蛋白(但有利地编码相同的蛋白)的多核苷酸，并且有利的是所述载体还表达所述多核苷酸，有利地在体内在适宜条件下或合适状况下或在合适的宿主细胞中。制剂含有一种或多种载体，所述载体含有、基本上组成或组成为，编码(并有利地表达，有利地在体内)FeLV肽、融合蛋白或其表位的多核苷酸。根据本发明的一个实施方案，表达载体是病毒载体，特别是体内表达载体。在有利的实施方案中，表达载体是腺病毒载体。有利的是，腺病毒载体是人Ad5载体，E1-缺失和/或E3-缺失的腺病毒。在一个特定实施方案中，病毒载体是痘病毒，如痘苗病毒或减毒痘苗病毒(例如MVA，Ankara疫苗株在鸡胚成纤维细胞上传代超过570次后获得的经修饰的Ankara株，见Stickl & Hochstein-Mintzel，Munch.Med.Wschr.，1971，113，1149-1153；Sutter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1992，89，10847-10851；可作为ATCCVR-1508得到；或NYVAC，见美国专利5,494,807，例如实施例1到6，以及下列等等，美国专利5,494,807，其中讨论了NYVAC的构建以及带有从哥本哈根株痘苗病毒基因组中删除的额外ORF的NYVAC变异以及将异源编码核酸分子插入该重组体的位点，以及匹配启动子的应用；也参见WO96/40241)，鸟痘病毒或减毒鸟痘病毒(如金丝雀痘，禽痘，斑鸠痘，鸽痘，鹌鹑痘，ALVAC或TROVAC；见例如美国专利号5,505,941，5,494,807)，猪痘病毒，浣熊痘病毒，骆驼痘病毒或粘液瘤病病毒。根据本发明的另一个实施方案，痘病毒载体是金丝雀痘病毒或禽痘病毒载体，有利的是减毒的金丝雀痘病毒或禽痘病毒。在这方面，金丝雀疸可获自ATCC登录号VR-111。减毒的金丝雀痘病毒描述于美国专利No.5,756,103(ALVAC)和WO01/05934。众多禽痘病毒疫苗接种株也可得到，例如由MERIAL上市的DIFTOSEC CT株和由INTERVET上市的NOBILIS VARIOLE疫苗；并可参考美国专利No.5,766,599，其涉及减毒的禽痘株TROVAC。有关生成其重组体的方法和如何施用其重组体的信息，技术人员可参考本文引用的文件和WO90/12882，例如，有关痘苗病毒，可提及美国专利No.4,769,330，4,722,848，4,603,112，5,110,587，5,494,807和5,762,938等等；有关禽痘，可提及美国专利No.5,174,993，5,505,941和US-5,766,599等；有关金丝雀痘，可提及美国专利No.5,756,103等；有关猪痘，可提及美国专利No.5,382,425等；以及有关浣熊痘，可提及WO00/03030等。当表达载体是痘苗病毒时，有待表达的多核苷酸的插入位点有利地在胸苷激酶(TK)基因或插入位点，血细胞凝集素(HA)基因或插入位点，编码A型包含体(ATI)的区域；还参见本文引用的文件，特别是涉及痘苗病毒的那些。在金丝雀痘的情况下，有利的是插入位点是ORF C3、C5和/或C6；还参见本文引用的文件，特别是涉及金丝雀痘病毒的那些。在禽痘的情况下，有利的是插入位点是ORF F7和/或F8；还参见本文引用的文件，特别是涉及禽痘病毒的那些。MVA病毒的插入位点有利地是如同在多种出版物中，包括Carroll M.W.等人，Vaccine，1997，15(4)，387-394；Stittelaar K.J.等人，J.Virol.，2000，74(9)，4236-4243；Sutter G.等人，1994，Vaccine，12(11)，1032-1040；并且在这方面，还注意到完整的MVA基因组描述于AntoineG.，Virology，1998，244，365-396，其使得技术人员能够使用其它插入位点或其它启动子。有利的是，有待表达的多核苷酸插入特定痘病毒启动子控制之下，如痘苗启动子7.5 kDa(Cochran等人，J.Virology，1985，54，30-35)，痘苗启动子I3L(Riviere等人，J.Virology，1992，66，3424-3434)，痘苗启动子HA(Shida，Virology，1986，150，451-457)，牛痘启动子ATI(Funahashi等人，J.Gen.Virol.，1988，69，35-47)，痘苗启动子H6(Taylor J.等人，Vaccine，1988，6，504-508；Guo P.等人J.Virol.，1989，63，4189-4198；Perkus M.等人，J.Virol.，1989，63，3829-3836)等等。在特定实施方案中，病毒载体是腺病毒，如人腺病毒(HAV)或犬腺病毒(CAV)。在一个实施方案中，病毒载体是人腺病毒，特别是血清型5腺病毒，通过病毒基因组的E1区域中的缺失(特别是从大约核苷酸459到大约核苷酸3510，参考hAd5的序列，公开于GenBank登录号M73260和参考文献出版物J.Chroboczek等人，Virol.1992，186，280-285中)而使得不能复制。缺失的腺病毒在表达E1的293(F.Graham等人，J.Gen.Virol.1977，36，59-72)或PER细胞特别是PER.C6(F.Falloux等人，Human Gene Therapy 1998，9，1909-1917)中繁殖。人腺病毒可以在E3区域中缺失，特别是从大约核苷酸28592到大约核苷酸30470。E1区域中的缺失可以和E3区域中的缺失结合进行(见J.Shriver等人Nature，2002，415，331-335，F.Graham等人，Methods in Molecular Biology Vol.7Gene Transfer andExpression Protocols Edited by E.Murray，The Human Press Inc，1991，p 109-128；Y.Ilan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.1997，94，2587-2592；US6,133,028；US6,692,956；S.Tripathy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.1994，91，11557-11561；B.Tapnell Adv.DrugDeliv.Rev.1993，12，185-199；X.Danthinne等人，Gene Thrapy2000，7，1707-1714；K.Berkner Bio Techniques 1988，6，616-629；K.Berkner等人，Nucl.Acid Res.1983，11，6003-6020；C.Chavier等人，J.Virol.1996，70，4805-4810)。最终在E1和/或E3区域部分或完全缺失后，插入位点可以为E1和/或E3基因座(区域)。有利的是，当表达载体是腺病毒时，有待表达的多核苷酸插入到在真核细胞中有功能的启动子的控制之下，如强启动子，优选巨细胞病毒即刻早期基因启动子(CMV-IE启动子)，特别是在M.Boshart等人，Cell 1985，41，521-530中从大约核苷酸-734到大约核苷酸+7的增强子/启动子区域，或者是来自Promega公司的pCI载体的增强子/启动子区域。CMV-IE启动子有利地是鼠或人来源的。也可使用延伸因子1α的启动子。在一个特定实施方案中，可以使用受缺氧调控的启动子如在K.Boast等人，Human Gene Therapy1999，13，2197-2208中所述的启动子HRE。还可以使用肌肉特异性启动子(X.Li等人，Nat.Biotechnol.1999，17，241-245)。本文还关于质粒载体讨论了强启动子。在一个实施方案中，剪接序列可位于增强子/启动子区域下游。例如，从CMV-IE基因中分离的内含子1(R.Stenberg等人，J.Virol.1984，49，190)，从兔或人的β-珠蛋白基因中分离的内含子，特别是b-珠蛋白的内含子2，从免疫球蛋白中分离的内含子，来自SV40早期基因的剪接序列，或者是从包含与小鼠免疫球蛋白受体序列融合的人β-珠蛋白供体序列的Promega公司的pCI载体中分离的嵌合内含子序列(Genbank中登录号为CVU47120中从大约890到大约核苷酸1022)。poly(A)序列和终止子序列可插入有待表达的多核苷酸的下游，如牛生长激素基因，特别是Genbank中登录号为BOVGHRH中从大约核苷酸2339到大约核苷酸2550，兔β-珠蛋白基因或SV40晚期基因多聚腺苷酸化信号。在另一个实施方案中，病毒载体为犬腺病毒，特别是CAV-2(见例如L.Fischer等人Vaccine，2002，20，3485-3497；美国专利5,529,780；美国专利5,688,920；PCT申请号WO95/14102)。对于CAV，插入位点可以是在E3区域中和/或在位于E4区域和右ITR区域之间的区域中(参见美国专利6,090,393；美国专利6,156,567)。在一个实施方案中，插入序列处于启动子控制之下，如巨细胞病毒即刻早期基因启动子(CMV-IE启动子)或已对人腺病毒载体描述的启动子。poly(A)序列和终止子序列可以插入有待表达的多核苷酸的下游，如牛生长激素基因或兔β-珠蛋白基因多聚腺苷酸化信号。在另一个特定实施方案中，病毒载体为疱疹病毒，如犬疱疹病毒(CHV)或猫疱疹病毒(FHV)。对于CHV，插入位点可以特别在胸苷激酶基因中、在ORF3中或在UL43ORF中(参见美国专利号6,159,477)。在一个实施方案中，有待表达的多核苷酸插入到在真核细胞中有功能的启动子控制之下，有利地是CMV-IE启动子(鼠或人)。在一个特定实施方案中，可以使用受缺氧调控的启动子，如在K.Boast等人，HumanGene Therapy1999，13，2197-2208中描述的启动子HRE。poly(A)序列和终止子序列可以插入到有待表达的多核苷酸的下游，如牛生长激素或兔β-珠蛋白基因多聚腺苷酸化信号。根据本发明又一个实施方案，表达载体是质粒载体或DNA质粒载体，特别是体内表达载体。在一个具体非限定性的实例中，可以将pVR1020或1012质粒(VICAL Inc.；Luke C.等人，Journal ofInfectious Diseases，1997，175，91-97；Hartikka J.等人，HumanGene Therapy，1996，7，1205-1217，见例如美国专利号5,846,946和6,451,769)用作载体以插入多核苷酸序列。pVR1020质粒源于pVR1012，包含人tPA信号序列。在一个实施方案中，人tPA信号包含Genbank中登录号HUMTPA14从氨基酸M(1)到氨基酸S(23)。在另一个具体非限定性实例中，用作插入多核苷酸序列的载体的质粒可以包含马IGF1的信号肽序列，Genbank中登录号U28070从氨基酸M(24)到氨基酸A(48)。关于可在实践中考虑...
【专利技术属性】
技术研发人员：T采盖，MC帕多，AT利尔德，
申请(专利权)人：梅瑞尔有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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