【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及mapple蛋白突变体及其在双标记嵌合分析中的应用。
技术介绍
1、热带爪蛙(xenopus tropicalis)是爪蛙属中唯一具有二倍体遗传背景的两栖类模式动物，具有易饲养，卵直径大，愈合能力强，体外受精，产卵量大，早期胚胎透明等特点，已逐渐发展成为发育生物学、再生医学和遗传学等研究领域的理想模式生物，可应用于发育与再生机制的探究、人类疾病模型研究和疾病靶向药物治疗的筛选。
2、双标记嵌合分析(mosaic analysis with double markers,madm)系统是基于cre诱导的translocation过程能同时实现特定细胞荧光标记、基因敲除及谱系示踪的分子遗传工具。madm系统的基本原理是将两个相互嵌合的标记基因(荧光蛋白)分别定位到同源染色体上的相同位点，其中一个嵌合基因包含绿色荧光蛋白(gfp)的n端和红色荧光蛋白(rfp)的c端(中间由含有loxp位点的内含子相连接)，而另一个嵌合基因包含rfp的n端和gfp的c端(中间由含有loxp位点的内含子相连接)。在没有cre的情况下，不表达功能性的gfp或rfp；但在特定时期、特定细胞中表达cre时，cre能诱导带有两种不同荧光蛋白n端的dna链与另一条带有相同荧光蛋白c端的dna链在细胞有丝分裂g2期发生染色体易位重组，使得两个子代细胞分别表达有任一种有功能性的荧光蛋白(称为：x-segregation)，或者其中一个子代细胞表达两种荧光蛋白而另一种子代细胞不带任何功能性荧光蛋白(称为：z-segregati
3、在同源染色体上的相同位点敲入该双荧光标记嵌合分析系统，可以通过染色体间重组在体内有效地诱导所有组织中的有丝分裂和有丝分裂后细胞的单荧光或双荧光标记，该方法可以实现在体内体细胞克隆或分离的单细胞中同时标记细胞和基因敲除。当突变位点选定为其中一个标记中时，在进行有丝分裂后，能够通过直接观察不同标记，实现单细胞分辨率的荧光标记突变细胞和另一种荧光标记的同级野生型细胞的表型分析。当使用野生型(即该位点的插入不导致原本的基因表达发生改变)双标记嵌合分析系统时，可以实现动态追踪两个同源细胞(gfp+和rfp+)，通过谱系示踪可以实现对发育过程细胞命运的深入了解。通过双荧光谱系追踪与单细胞水平的表型分析相结合，揭示发育过程和疾病机制的更复杂的细节，对组织器官发育、再生及修复的研究具有重要意义。因此，双荧光标记嵌合分析一旦广泛应用于这些领域，将带来突破性的发现。
4、任何有机荧光团在长时间照射下都会发生不可逆的光漂白，提高荧光蛋白的亮度可以减少筛选荧光标记位点时所需的时间。新型红色荧光蛋白mapple被证实其在斑马鱼胚胎中比其他rfp更加明亮，因此构建含有mapple荧光蛋白的嵌合分析系统可以实现体外和体内高效的红色荧光标记。最近已有科研团队利用mapple作为红色荧光标记，egfp作为绿色荧光标记，构建了适用于斑马鱼模式动物的双荧光标记嵌合分析系统(zmadm)，并利用双荧光标记系统在双谱系追踪与单细胞水平的表型分析的优势，成功获得斑马鱼视顶盖神经元柱细胞的不对等分裂的证据，进一步证实了zmadm系统在水生动物器官发育机制研究领域的独特优势(zmadm(zebrafish mosaic analysis with double markers for single-cell gene knockout and dual-lineage tracing,2022,119(9):e2122529119)。
5、为了进一步探索zmadm系统是否能在热带爪蛙模型中有效工作，专利技术人首先克隆了上述研究中zmadm系统的嵌合基因片段(n-egfp::c-mapple,ga；n-mapple::c-egfp,ag)，并将其连接到pcag-egfp载体(由pbs-t2a-egfp-bghpa载体(见本实验室已发表文章：29897811)经本实验室改造所得)中cag启动子下游的bamhi与ecori酶切位点之间，替换原有egfp片段，进而构建pcag-ga，以及pcag-ag表达载体。然而，将上述载体转染293t细胞进行功能验证时，我们发现转染pcag-ga和pcag-cre载体(addgene,#13775，经本实验室改造)的细胞没有绿色荧光表达，但有红色荧光表达(gfp-/rfp+)；转染pcag-ag和pcag-cre载体的细胞没有任何荧光表达(gfp-/rfp-)；pcag-ga、pcag-ag和pcag-cre三个载体共同转染的293t细胞中既有绿色荧光又有红色荧光表达(gfp+/rfp+)，而且表达红色荧光的细胞数量远高于表达绿色荧光的细胞数量。上述结果表明：pcag-ga表达载体转染细胞后发生红色荧光泄露，这将严重影响利用上述zmadm系统进行细胞命运示踪及进行单细胞水平表型分析的精确性与可靠性。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有基于mapple作为红色荧光标记蛋白的zmadm系统存在荧光泄露问题的缺点与不足，提供一种无荧光泄露的双标记嵌合分析系统。
2、本专利技术的另一方面是提供两组mapple蛋白n端截短型突变体。
3、本专利技术的目的通过以下技术方案实现：
4、一种无荧光泄露的双标记嵌合分析系统，命名为madm2.0，包括cre重组酶载体，双标记嵌合片段1载体和双标记嵌合片段2载体，其中：
5、所述的双标记是指绿色荧光蛋白egfp和红色荧光蛋白mapple，其核苷酸序列分别如seq id no:1、seq id no:2所示；
6、所述的双标记嵌合片段1由绿色荧光蛋白egfp的n端1位～274位碱基与红色荧光蛋白mapple的c端61位～711位碱基通过含有loxp位点的内含子相连接得到；所述的双标记嵌合片段2由红色荧光蛋白mapple的n端1位～60位碱基与绿色荧光蛋白egfp的c端275位～720位碱基通过含有loxp位点的内含子相连接得到；
7、或者，所述的双标记嵌合片段1由绿色荧光蛋白egfp的n端1位～274位碱基与红色荧光蛋白mapple的c端73位～711位碱基通过含有loxp位点的内含子相连接得到；所述的双标记嵌合片段2由红色荧光蛋白mapple的n端1位～72位碱基与绿色荧光蛋白egfp的c端275位～720位碱基通过含有loxp位点的内含子相连接得到。
8、进一步地，所述的双标记嵌合片段1载体、双标记嵌合片段2载体的核苷酸序列分别如seq id no:3、seq id no:4所示。
9、进一步地，所述的双标记嵌合片段1载体、双标记嵌合片段2载体通过如下方法制备得到：
10、s1、分别以质粒序列数据库addgene中编号为#182155的ptol2-eab2-ag载体中的ag嵌合基因片段的dna序列为模板，以质粒序列数据库addgene中本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种无荧光泄露的双标记嵌合分析系统，其特征在于：命名为MADM2.0，包括Cre重组酶载体，双标记嵌合片段1载体和双标记嵌合片段2载体，其中：
2.根据权利要求1所述的无荧光泄露的双标记嵌合分析系统，其特征在于：
3.根据权利要求1或2所述的无荧光泄露的双标记嵌合分析系统，其特征在于：
4.mApple蛋白N端截短型突变体，其特征在于：与SEQ ID NO:8相比，所述mApple蛋白N端截短型突变体中存在以下突变中的至少一种：
5.核酸分子，其特征在于：为编码权利要求4中所述的mApple蛋白N端截短型突变体的核酸分子；其中，编码1)中mApple蛋白N端截短型突变体的核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO:9的第58位到第708位碱基所示；编码2)中mApple蛋白N端截短型突变体的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:9的第70位到第708位碱基所示。
6.生物材料，其特征在于：为含有权利要求5中所述的核酸分子的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
7
8.权利要求1-3任一项中所述的双标记嵌合分析系统、权利要求4中所述的mApple蛋白N端截短型突变体、权利要求5中所述的核酸分子、权利要求6中所述的生物材料或权利要求7中所述的相互嵌合基因组在双标记嵌合分析中的应用。
9.权利要求1-3任一项中所述的双标记嵌合分析系统在双谱系追踪和/或单细胞水平表型分析中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：
...【技术特征摘要】
1.一种无荧光泄露的双标记嵌合分析系统，其特征在于：命名为madm2.0，包括cre重组酶载体，双标记嵌合片段1载体和双标记嵌合片段2载体，其中：
2.根据权利要求1所述的无荧光泄露的双标记嵌合分析系统，其特征在于：
3.根据权利要求1或2所述的无荧光泄露的双标记嵌合分析系统，其特征在于：
4.mapple蛋白n端截短型突变体，其特征在于：与seq id no:8相比，所述mapple蛋白n端截短型突变体中存在以下突变中的至少一种：
5.核酸分子，其特征在于：为编码权利要求4中所述的mapple蛋白n端截短型突变体的核酸分子；其中，编码1)中mapple蛋白n端截短型突变体的核酸分子的核苷酸序列如seq idno:9的第58位到第708位碱基所示；编码2)中mapple蛋白n端截短型突...
【专利技术属性】
技术研发人员：齐绪峰，林金花，文娜，郑莉，蔡冬青，吴海燕，冯珊珊，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：
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