【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学，具体涉及一种检测土壤与菌剂中丛枝菌根真菌数量的qpcr方法。
技术介绍
1、丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，amf)作为广泛存在于陆地生态系统中的植物共生真菌，因其在植物适应各种逆境胁迫中的积极作用及重要生态功能而受到日益广泛的关注。在进化过程中，丛枝菌根真菌逐渐失去了自身降解有机物的能力，无法营腐生生长，与宿主植物之间形成了依赖于碳水化合物-矿质养分交换的专性共生体系。丛枝菌根真菌从植物体内获取生长发育所必要的碳源与能源物质，同时丛枝菌根真菌通过多种途径提高共生植物对水分、营养元素的吸收和重金属元素的固持,促进植株生长,特别是对胁迫环境中p、钾(k)等的吸收以及植物干重增加具有重要意义。此外，丛枝菌根真菌的形成对于促进植物提高植物抗病性、抗逆能力以及提高作物品质具有重要意义。并且，不同植物种类对丛枝菌根真菌具有一定的特异招募性,植株年龄与生长阶段、根系状况都会影响丛枝菌根真菌孢子分布。丛枝菌根真菌与植物之间的相互选择和合理匹配，是影响植物养分获取和菌丝发育的关键。随着我国生态农业的发展,丛枝菌根真菌的研究及应用受到了广泛关注。当前，宿主植物体内丛枝菌根真菌的分类鉴定和定量检测的分子手段已有成熟的研究方法报道。
2、丛枝菌根真菌的孢子是丛枝菌根真菌鉴定的重要依据，但其存在着分离过程繁琐，鉴定难度高等难点，使得丛枝菌根真菌的检测效果并不理想。并且由于我国不同地区土壤理化性质差别较大，真菌细胞壁难以打破且破壁后基因组受损较大等原因导致提取的土壤总dna中丛
3、cn 106011256 a公开了一种基于实时荧光定量pcr检测小麦根际土壤中丛枝菌根真菌数量的方法，可对小麦整个生长期根际土壤中丛枝菌根真菌的数量进行检测。但不同地区土壤的土壤类型差异较大，该专利提供的qpcr定量检测方法在整个样品检测过程都未选择合适内参进行有效的校正，可能会影响土壤中丛枝菌根真菌数量检测的准确性，使检测结果存在偏差。
技术实现思路
1、本专利技术针对上述技术问题，提出了一种检测土壤与菌剂中丛枝菌根真菌数量的qpcr方法，以实验室克隆的丛枝菌根真菌特异性基因片段作为标准片段，设计了特异性荧光定量引物，采用已知浓度的标准梯度丛枝菌根真菌孢子溶液作为对照，对土壤与菌剂中丛枝菌根真菌的提取率进行校正，对土壤与菌剂中丛枝菌根真菌的数量进行检测，可消除各种因素造成的丛枝菌根真菌回收效率偏差，其检测下限可达38个孢子/克土或10个孢子/毫升菌剂。
2、为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
3、本专利技术第一方面，提供了一种用于检测土壤或菌剂中丛枝菌根真菌的引物对，包括：用于特异性荧光定量的引物对risr-qf/qr，其核苷酸序列如seq id no.3-seq id no.4所示。
4、本专利技术第二方面，提供了上述引物对在制备检测土壤或菌剂中丛枝菌根真菌产品中的应用。
5、本专利技术第三方面，提供了一种检测土壤或菌剂中丛枝菌根真菌的试剂盒，所述试剂盒含有上述引物对。
6、所述试剂盒还包括：2×universal sybr green fast qpcr mix、模板、ddh2o。
7、所述试剂盒的反应体系为：2×universal sybr green fast qpcr mix 10μl，risr-qf/risr-qr引物浓度10um各0.4μl；模板2μl，ddh2o补充至20μl；所述试剂盒的反应程序为95℃3min；95℃5sec，60℃30sec，40-45个循环；72℃10min；熔解曲线根据仪器自动设置。
8、本专利技术第四方面，提供了一种检测土壤或菌剂中丛枝菌根真菌数量的qpcr方法，所述方法使用上述试剂盒进行检测。
9、所述qpcr方法，包括如下步骤：
10、(1)提取丛枝菌根真菌dna作为模板进行pcr扩增，得到标准线性片段，利用标准线性片段进行qpcr反应绘制标准曲线，得到线性回归方程；
11、(2)配置标准土壤或菌剂样本，提取标准土壤或菌剂样本dna进行qpcr反应，计算标准土壤或菌剂样本平均定量拷贝数和理论拷贝数，得到amf提取率；
12、(3)提取待检测土壤或菌剂中丛枝菌根真菌dna进行qpcr反应，利用线性回归方程，结合amf提取率校正结果，计算待检测土壤或菌剂中丛枝菌根真菌数量。
13、所述标准线性片段核苷酸序列如seq id no.9所示。
14、所述amf提取率＝标准土壤或菌剂中平均定量拷贝数÷标准土壤或菌剂中理论拷贝数；待检测土壤或菌剂中丛枝菌根真菌数量＝待检测土壤或菌剂中丛枝菌根真菌的检测含量÷amf提取率。
15、所述提取待检测土壤或菌剂中丛枝菌根真菌dna时，优选的，还包括浓缩的步骤。
16、本专利技术的有益效果：
17、设计了针对丛枝菌根真菌的专用引物，该引物在给定的反应条件下，引物对于检测样品高度敏感，能够特异性地检测出土壤与菌剂中丛枝菌根真菌，具有良好的可重复性。本专利技术采用已知浓度的标准梯度丛枝菌根真菌孢子溶液和已知浓度的标准梯度丛枝菌根真菌土壤作为对照，能够对土壤与菌剂中丛枝菌根真菌基因组的提取率进行校正，减少实验误差，使定量结果更精准。本专利技术所建立的qpcr体系检测灵敏度高，特异性强，定量准确，稳定性好，在同一体系中不受其它生物信息干扰，对土壤与菌剂中丛枝菌根真菌孢子的检测有着重要的意义。
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1.一种用于检测土壤或菌剂中丛枝菌根真菌的引物对，其特征在于，包括：用于特异性荧光定量的引物对RiSR-qF/qR，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示。
2.权利要求1所述的引物对在制备检测土壤或菌剂中丛枝菌根真菌产品中的应用。
3.一种检测土壤或菌剂中丛枝菌根真菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的引物对。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：2×Universal SYBRGreen Fast qPCR Mix、模板、ddH2O。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系为：2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix 10μL，RiSR-qF/RiSR-qR引物浓度10uM各0.4μL；模板2μL，ddH2O补充至20μL；所述试剂盒的反应程序为95℃3min；95℃5sec，60℃30sec，40-45个循环；72℃10min；熔解曲线根据仪器自动设置。
6.一种检测土壤或菌剂中丛枝菌根真菌
7.根据权利要求6所述的qPCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的qPCR方法，其特征在于，所述标准线性片段核苷酸序列如SEQID NO.9所示。
9.根据权利要求7所述的qPCR方法，其特征在于，所述AMF提取率＝标准土壤或菌剂中平均定量拷贝数÷标准土壤或菌剂中理论拷贝数；待检测土壤或菌剂中丛枝菌根真菌数量＝待检测土壤或菌剂中丛枝菌根真菌的检测含量÷AMF提取率。
10.根据权利要求7所述的qPCR方法，其特征在于，所述提取待检测土壤或菌剂中丛枝菌根真菌DNA时，优选的，还包括浓缩的步骤。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测土壤或菌剂中丛枝菌根真菌的引物对，其特征在于，包括：用于特异性荧光定量的引物对risr-qf/qr，其核苷酸序列如seq id no.3-seq id no.4所示。
2.权利要求1所述的引物对在制备检测土壤或菌剂中丛枝菌根真菌产品中的应用。
3.一种检测土壤或菌剂中丛枝菌根真菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的引物对。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：2×universal sybrgreen fast qpcr mix、模板、ddh2o。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系为：2×universal sybr green fast qpcr mix 10μl，risr-qf/risr-qr引物浓度10um各0.4μl；模板2μl，ddh2o补充至20μl；所述试剂盒...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁新华，徐新宁，刘保友，李洋，尹梓屹，路冲冲，赵海朋，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：
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