【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种pl24家族石莼多糖裂解酶、编码基因及其突变体和应用。
技术介绍
1、海藻是海洋生物资源的重要组成部分，绿藻作为三大藻类之一，在全球海藻产量中占比<1%，红藻和褐藻则占据主导地位。虽然一些绿藻在亚洲的某些国家作为食品，但其多糖的研究和应用与前两者相比相对较少。由于绿潮（主要是石莼属绿藻）的出现，人们开始重视绿藻的应用，如石莼、浒苔等可作为饲料、食品和药物开发的原料。绿藻中的活性物质有多糖类、蛋白类、萜类、甾醇类、多酚类、环状多硫化合物、大环内酯类等，近年来，多糖类物质仍然是学者们研究的重点，其具有抗肿瘤、抗病毒、抗心血管疾病等活性，应用前景良好。
2、石莼多糖是绿藻中的主要多糖类物质，其主要由硫酸鼠李糖、葡萄糖醛酸、木糖和艾杜糖醛酸组成。但石莼多糖分子量大、粘度大、生物利用度低，影响其生物学功能的发挥；而降解后的石莼寡糖粘度小、溶解度好、易吸收、活性基团暴露多，具有更好的生物学功能。目前制备石莼寡糖的方法主要有化学降解、物理降解和生物降解。化学降解和物理降解均为非特异性降解，反应过程不易控制、分子量分布范围广，且化学降解易造成环境污染，物理降解成本高、操作复杂，均不适合大规模工业化生产。而生物降解是生产石莼寡糖的主要方法之一，具有反应高效温和、产物结构均一、活性基团保持良好、底物专一性好等优势，且能耗低、无污染，受到越来越多的关注。
3、生物降解主要通过具有特异性功能的微生物或石莼多糖裂解酶实现。目前可降解石莼多糖的微生物主要有 vibri
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种pl24家族石莼多糖裂解酶、编码基因及其突变体和应用。所述的石莼多糖裂解酶alt559属于pl24家族，酶蛋白序列与现有酶序列相似度较低，是一种新型的石莼多糖裂解酶。另外，所述的石莼多糖裂解酶alt559酶活力高达1376.02 u/ml，具有良好的ph稳定性，能够高效催化降解绿藻多糖制备绿藻低聚糖，应用前景广泛。
2、为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
3、本专利技术提供了一种pl24家族石莼多糖裂解酶，其具有下列氨基酸序列之一：
4、（1）如seq id no.1所示的氨基酸序列；
5、（2）由seq id no.1所示的氨基酸序列经一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加，且具有与seq id no.1所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。
6、进一步的，所述石莼多糖裂解酶的适宜反应温度为40℃~50℃。
7、进一步的，所述石莼多糖裂解酶在30℃以下具有良好的温度稳定性。
8、进一步的，所述石莼多糖裂解酶的适宜反应ph为8.0~9.0。
9、进一步的，所述石莼多糖裂解酶在ph 7.0~10.0具有良好的ph稳定性。
10、进一步的，k+和ba2+能显著促进所述石莼多糖裂解酶的酶活力。
11、本专利技术还提供了一种石莼多糖裂解酶的编码基因，其编码的是所述的石莼多糖裂解酶，具有下列核苷酸序列之一：
12、（1）如seq id no.2所示的核苷酸序列；
13、（2）与seq id no.2所示的核苷酸序列具有95%以上同源性且编码与seq id no.1所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列。
14、本专利技术还提供了含有所述的编码基因的重组载体。
15、进一步的，所述重组载体为大肠杆菌表达载体pet-22b(+)。
16、本专利技术还提供了含有所述的编码基因的重组菌株。
17、进一步的，所述的重组菌株为大肠杆菌rosetta(de3)。
18、本专利技术还提供了所述的石莼多糖裂解酶在催化降解绿藻多糖中的应用。
19、进一步的，所述石莼多糖裂解酶的酶液用量为绿藻多糖溶液的10%~30%。
20、进一步的，所述石莼多糖裂解酶的催化降解绿藻多糖的时间不少于30min。
21、本专利技术还提供了所述的石莼多糖裂解酶在制备石莼寡糖中的应用。
22、进一步的，所述石莼多糖裂解酶的酶液用量为石莼多糖溶液的5%~20%，酶解时间不少于4 h。
23、本专利技术还提供了一种酶活提高的石莼多糖裂解酶突变体a216t-f277y，其氨基酸序列如seq id no.29所示，其编码基因的核苷酸序列如seq id no.31所示；所述突变体a216t-f277y是由氨基酸序列为seq id no.1的石莼多糖裂解酶的第216位氨基酸由ala变为thr和第277位氨基酸由phe变为tyr获得的。
24、本专利技术还提供了一种酶活提高的石莼多糖裂解酶突变体t89s-f277y，其氨基酸序列如seq id no.30所示，其编码基因的核苷酸序列如seq id no.32所示；所述突变体t89s-f277y是由氨基酸序列为seq id no.1的石莼多糖裂解酶的第89位氨基酸由thr变为ser和第277位氨基酸由phe变为tyr获得的。
25、与现有技术对比，本专利技术的优点和有益效果：
26、本专利技术通过特异性无缝克隆引物，获得pl24家族石莼多糖裂解酶基因，该基因全长1479 bp，编码492个氨基酸，进而得到石莼多糖裂解酶alt559；所述的石莼多糖裂解酶的氨基酸序列与现有的石莼多糖裂解酶氨基酸序列有显著差异，因此其属于一种全新的石莼多糖裂解酶。
27、本专利技术不仅实现了新的pl24家族石莼多糖裂解酶重组载体的构建及大肠杆菌高效表达，还实现石莼多糖裂解酶的规模化生产，扩充石莼多糖裂解酶家族的数量。本专利技术提供的石莼多糖裂解酶alt559的酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种PL24家族石莼多糖裂解酶，其特征在于，所述PL24家族石莼多糖裂解酶具有下列氨基酸序列之一：
2.一种石莼多糖裂解酶的编码基因，其特征在于，所述编码基因编码的是权利要求1所述的石莼多糖裂解酶，其具有下列核苷酸序列之一：
3.一种含有权利要求2所述的编码基因的重组载体。
4.一种含有权利要求2所述的编码基因的重组菌株。
5.权利要求1所述的石莼多糖裂解酶在催化降解绿藻多糖中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述石莼多糖裂解酶的酶液用量为绿藻多糖溶液的10%~30%，催化降解绿藻多糖的时间不少于30min。
7.权利要求1所述的石莼多糖裂解酶在制备石莼寡糖中的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述石莼多糖裂解酶的酶液用量为石莼多糖溶液的5%~20%，酶解时间不少于4 h。
9. 一种酶活提高的石莼多糖裂解酶突变体A216T-F277Y，其特征在于，所述突变体A216T-F277Y的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示，其编码基因的核苷酸序列
10. 一种酶活提高的石莼多糖裂解酶突变体T89S-F277Y，其特征在于，所述突变体T89S-F277Y的氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示；所述突变体T89S-F277Y是由氨基酸序列为SEQ ID NO.1的石莼多糖裂解酶的第89位氨基酸由Thr变为Ser和第277位氨基酸由Phe变为Tyr获得的。
...【技术特征摘要】
1.一种pl24家族石莼多糖裂解酶，其特征在于，所述pl24家族石莼多糖裂解酶具有下列氨基酸序列之一：
2.一种石莼多糖裂解酶的编码基因，其特征在于，所述编码基因编码的是权利要求1所述的石莼多糖裂解酶，其具有下列核苷酸序列之一：
3.一种含有权利要求2所述的编码基因的重组载体。
4.一种含有权利要求2所述的编码基因的重组菌株。
5.权利要求1所述的石莼多糖裂解酶在催化降解绿藻多糖中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述石莼多糖裂解酶的酶液用量为绿藻多糖溶液的10%~30%，催化降解绿藻多糖的时间不少于30min。
7.权利要求1所述的石莼多糖裂解酶在制备石莼寡糖中的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述石莼多糖裂解酶的酶液用量为石莼多糖溶液的5%~20%，酶...
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