【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药。更具体地说，本专利技术涉及crispr-cas9纳米抗菌剂及其制备方法。
技术介绍
1、耐药菌感染严重威胁人类健康，特别是抗生素的广泛使用甚至滥用，加速了细菌产生耐药性。who将耐药碳青霉铜绿假单胞菌、肠杆菌科和鲍曼不动杆菌列为对人类健康会产生重大威胁的超级细菌，呼吁研究者开发新的策略来抵御这些超级细菌。
2、crispr/cas是细菌抵抗噬菌体感染的免疫系统，后被开发为一种高效基因编辑工具，其中crispr/cas9最为常用。cas9是细菌ii型crispr免疫系统中的一种双链dna核酸酶，在向导rna（sgrna）的引导下可在任意指定位置切割双链dna。crispr/cas9可通过cas9核酸酶引起不可修复的dna双链断裂、失活耐药基因、敲除致命基因及对细菌毒素-抗毒素系统的重编程发挥杀菌作用。作为一种序列特异性的抗菌工具，crispr/cas9只靶向目标病原菌dna，不影响其他细菌。crispr/cas9进入细菌才能发挥作用，将其安全有效地递送到细菌内部是crispr/cas9抗耐药菌感染的主要挑战。
3、细菌外膜囊泡由细菌分泌，大小在20~300nm，组成与细菌外膜相似，具有双层脂膜结构及含有外膜蛋白，参与细菌间耐药质粒、毒力因子等物质转运，被认为是一种独特的细菌分泌途径。外膜蛋白对细菌外膜囊泡介导的物质转运功能非常重要，常以细菌外膜囊泡中所含外膜蛋白的量间接代表细菌外膜囊泡的量。细菌外膜囊泡本身不可复制性，因此使用较为安全，现已作为药物递送系统、疫苗和免疫佐剂。
<...【技术保护点】
1.CRISPR/Cas9纳米抗菌剂，其特征在于，包括：纳米载体和CRISPR/Cas9；
2.如权利要求1所述的CRISPR/Cas9纳米抗菌剂，其特征在于，所述CRISPR/Cas9能表达Cas9和sgRNA。
3.如权利要求1所述的CRISPR/Cas9纳米抗菌剂，其特征在于，所述纳米载体由阳离子脂质和细菌外膜囊泡组成。
4.如权利要求3所述的CRISPR/Cas9纳米抗菌剂，其特征在于，所述阳离子脂质为双十二烷基二甲基溴化铵、二油酰磷脂酰乙醇胺、1-辛基壬基8-[(2-羟乙基)[6-O-6-(十一烷氧基)己基]氨基]-辛酸酯、溴化三甲基-2, 3-二油酰氧基丙基铵、氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵和4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯中的一种或几种。
5.如权利要求4所述的CRISPR/Cas9纳米抗菌剂，其特征在于，所述阳离子脂质为双十二烷基二甲基溴化铵、二油酰磷脂酰乙醇胺和溴化三甲基-2, 3-二油酰氧基丙基铵中的一种或几种。
6.如权利要求5所述的CRISPR/Cas9纳米抗菌剂，其特征在于，
7.如权利要求3所述的CRISPR/Cas9纳米抗菌剂，其特征在于，所述细菌外膜囊泡为靶细菌同源的外膜囊泡。
8.如权利要求1所述的CRISPR/Cas9纳米抗菌剂，其特征在于，所述纳米载体的粒径为20~1000nm。
9.如权利要求3所述的CRISPR/Cas9纳米抗菌剂，其特征在于，纳米载体中外膜蛋白和阳离子脂质的质量比为0.01:100~15:100。
10.如权利要求1所述的CRISPR/Cas9纳米抗菌剂，其特征在于，所述CRISPR/Cas9为细菌质粒DNA，细菌质粒DNA、纳米载体中阳离子脂质的质量比为0.01:100~15:100。
11.如权利要求1所述的CRISPR/Cas9纳米抗菌剂，其特征在于，所述脂质/细菌外膜杂化囊泡纳米载体的制备方法为：取15mg双十二烷基二甲基溴化铵，10mg蛋黄卵磷脂和5mg胆固醇加入6mL无水乙醇溶解，在45℃水浴条件下旋蒸除去有机溶剂，形成均匀的薄膜，45℃水浴条件下加入6mL磷酸盐缓冲液水化10分钟，所得乳液依次通过0.45μm和0.22μm滤膜除去杂质，得到空白阳离子脂质体；鲍曼不动杆菌在LB培养基中培养至对数生长后期，3500×g离心后弃菌体，上清于150000×g离心70分钟，加入磷酸盐缓冲液重悬，得细菌外膜囊泡，采用BCA试剂盒测定细菌外膜囊泡总蛋白，磷酸盐缓冲液稀释调整至0.25mg/mL；上述空白阳离子脂质体和细菌外膜囊泡各1mL，混合后探头超声，得脂质/细菌外膜杂化囊泡纳米载体。
12.如权利要求3所述的CRISPR/Cas9纳米抗菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将阳离子脂质体和细菌外膜囊泡混合，探头超声融合后通过0.22μm滤膜除去杂质，加入CRISPR/Cas9质粒电致孔1～5次，得CRISPR/Cas9纳米抗菌剂。
13.如权利要求1所述的CRISPR/Cas9纳米抗菌剂，被剂型化成肺吸入、口服、静脉注射、皮下注射、直肠灌注、滴眼、皮肤表面局部或全身经皮用。
...【技术特征摘要】
1.crispr/cas9纳米抗菌剂，其特征在于，包括：纳米载体和crispr/cas9；
2.如权利要求1所述的crispr/cas9纳米抗菌剂，其特征在于，所述crispr/cas9能表达cas9和sgrna。
3.如权利要求1所述的crispr/cas9纳米抗菌剂，其特征在于，所述纳米载体由阳离子脂质和细菌外膜囊泡组成。
4.如权利要求3所述的crispr/cas9纳米抗菌剂，其特征在于，所述阳离子脂质为双十二烷基二甲基溴化铵、二油酰磷脂酰乙醇胺、1-辛基壬基8-[(2-羟乙基)[6-o-6-(十一烷氧基)己基]氨基]-辛酸酯、溴化三甲基-2, 3-二油酰氧基丙基铵、氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵和4-(n,n-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯中的一种或几种。
5.如权利要求4所述的crispr/cas9纳米抗菌剂，其特征在于，所述阳离子脂质为双十二烷基二甲基溴化铵、二油酰磷脂酰乙醇胺和溴化三甲基-2, 3-二油酰氧基丙基铵中的一种或几种。
6.如权利要求5所述的crispr/cas9纳米抗菌剂，其特征在于，所述阳离子脂质为双十二烷基二甲基溴化铵。
7.如权利要求3所述的crispr/cas9纳米抗菌剂，其特征在于，所述细菌外膜囊泡为靶细菌同源的外膜囊泡。
8.如权利要求1所述的crispr/cas9纳米抗菌剂，其特征在于，所述纳米载体的粒径为20~1000nm。
9.如权利要求3所述的crispr/cas9纳米抗菌剂，其特征在于，纳米载体中外膜蛋白和阳离子脂质的质量...
【专利技术属性】
技术研发人员：金义光，贾学丽，袁伯川，杜丽娜，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：
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