【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术，具体为一种基于sanger法检测幽门螺杆菌s/l-htra的试剂盒及方法。
技术介绍
1、幽门螺杆菌(helicobacter pylori，hp)是一种寄生在胃部的革兰氏阴性微需氧细菌，hp感染可导致胃炎、胃溃疡以及胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌。1994年世界卫生组织(who)下属的国际癌症研究机构(international agency for research on cancer，iarc)就将hp定为胃癌的i类致癌原。2021年12月，美国卫生及公共服务部下属美国毒理研究项目(ntp)又将幽门螺杆菌慢性感染列为明确人类致癌物。全球约50％的人感染了幽门螺杆菌，但是感染者终身罹患胃癌的风险为1-5％，这可能是由于hp致病能力存在一定差异。目前，大量研究表明幽门螺杆菌菌株致病性的差异主要与其毒力基因型致癌蛋白细胞毒素a(caga)和空泡细胞毒素a(vaca)有关。caga位于cagpai，主要通过ⅳ型分泌系统(t4ss)进入宿主细胞，但幽门螺杆菌不能从胃上皮细胞的顶端注射caga，而需要穿过上皮细胞层，进入到靠近基底层的上皮细胞尾端，注射器t4ss才能发挥作用，将毒性因子caga注入上皮细胞。在这个过程中，可以将黏连在一起的上皮细胞分开的丝氨酸蛋白酶htra发挥着重要的作用。
2、最新研究表明，幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶htra中一个碱基的替换，会导致第171位氨基酸从丝氨酸变成亮氨酸(171s→l)，这与胃癌的发生显著相关。171s型htra大多以单体形式存在，不能有效切割连接蛋白，而1
3、目前已有针对个别幽门螺杆菌毒力基因(例如caga和vaca)分型的检测方法及抗体试剂盒，但是暂无可以对幽门螺杆菌htra进行分型的检测试剂盒、方法。因此，本专利技术针对htra的分型检测提供了一种简便、快速、准确的检测方法及试剂盒。
技术实现思路
1、(一)解决的技术问题
2、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种基于sanger法检测幽门螺杆菌s/l-htra的试剂盒及方法，采用pcr扩增、结合sanger测序技术，可快速准确地检测患者幽门螺杆菌htra的分型，为幽门螺杆菌的治疗提供指导。
3、(二)技术方案
4、为实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：基于sanger法检测幽门螺杆菌s/l-htra的试剂盒及方法，所述试剂盒包括：
5、(2)pcr扩增反应试剂：2.5×pcr mix、pcr扩增引物；
6、(2)测序试剂：hidi、bigdye；
7、(3)去离子水、阳性对照品和阴性对照品。
8、优选的，所述pcr扩增引物是：
9、上游引物(seq-f)：taccattccagggagcaataaag
10、下游引物(seq-r)：gatggaagcgtctgtttgaatga
11、优选的，所述pcr扩增引物seq-f与seq-r在体系内的浓度均为0.2mm。
12、优选的，包括以下步骤：
13、(1)待测粪便样本dna提取；
14、(2)利用pcr扩增引物seq-f与seq-r，以待测粪便dna为模板进行扩增，获得pcr产物；
15、(3)将普通pcr产物进行纯化；
16、(4)将步骤(3)获得的纯化产物进行测序，得到碱基序列和峰图；
17、(5)将步骤(4)的测序结果与参考序列进行比较，确定htra分型。若检测样本测序结果与参考序列一致，则判定htra为s型；若检测样本在第171位氨基酸发生突变，则判定htra为l型。
18、优选的，步骤(2)中，所述pcr扩增的反应体系包括：2.5×pcr mix 8μl、10μmol/l上游引物(seq-f)1μl、10μmol/l下游引物(seq-r)1μl、去离子水5μl、粪便样本dna5μl。
19、优选的，步骤(2)中，所述pcr扩增反应程序参数为：95℃2min；依次95℃10s，60℃30s，72℃40s，进行40个循环；72℃5min延伸；4℃保温。
20、优选的，步骤(3)中，所述pcr产物纯化是使用磁珠法琼脂糖凝胶dna回收试剂盒。
21、优选的，步骤(4)中，所述测序是基于sanger双脱氧链终止法进行一代测序。
22、优选的，所述试剂盒的保存方式为环氧冷冻液的环境中；所述环氧冷冻液的制备方法为：
23、s1.向n,n-二甲基甲酰胺溶剂中加入6-10重量份的间氯苯乙烯进行溶解，溶解后加入10-15重量份的1-(3-氨丙基)咪唑进行取代反应，在70-90℃下反应15-20h，反应后减压蒸馏除去溶剂，过滤并干燥，得到咪唑基苯乙烯；
24、s2.向二氯甲烷中加入5-10重量份的咪唑基苯乙烯和4-8重量份的(3-羧丙基)三甲基氯化铵进行溶解，然后再向其加入1-2重量份的n,n-二环己基碳二亚胺、0.2-0.5重量份的n-羟基丁二酰亚胺进行反应，在50-70℃下反应4-10h，反应后得到季铵-咪唑-苯乙烯；
25、s3.向n,n-二甲基甲酰胺溶剂中加入4-7重量份的季铵-咪唑-苯乙烯和3-6重量份的丙烯醇进行搅拌，然后在加入0.3-0.5重量份的偶氮二异丁腈进行聚合反应，在80-110℃下反应6-10h，反应后得到环氧苯乙烯；然后将环氧苯乙烯加入冰水中搅拌，得到环氧冷冻液。
26、(三)有益的技术效果
27、1.本专利技术提出了对幽门螺杆菌171s/l htra的检测，为医生判断患者感染hp的危害程度提供信息，预测病情未来转归的情况，提示胃癌高发人群，从而准确指导治疗方案，精确用药；其中环氧冷冻液可以帮助试剂盒进行保存，和消灭空气中细菌中的效果。
28、2.本专利技术设计了扩增幽门螺杆菌的htra基因核苷酸序列的引物，只要粪便样本中存在幽门螺杆菌，不需要幽门螺杆菌体外培养，直接能通过粪便样本提取核酸；采用pcr技术与sanger测序技术，通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于SANGER法检测幽门螺杆菌S/L-HTRA的试剂盒及方法，其特征在于，所述试剂盒包括：
2.根据权利要求1所述的基于SANGER法检测幽门螺杆菌S/L-HTRA的试剂盒及方法，其特征在于，所述PCR扩增引物是：
3.根据权利要求1基于Sanger法检测幽门螺杆菌S/L-HtrA的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增引物SEQ-F与SEQ-R在体系内的浓度均为0.2Mm。
4.一种基于Sanger法检测幽门螺杆菌S/L-HtrA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的一种基于Sanger法检测幽门螺杆菌S/L-HtrA的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR扩增的反应体系包括：2.5×PCR mix 8μL、10μmol/L上游引物(SEQ-F)1μL、10μmol/L下游引物(SEQ-R)1μL、去离子水5μL、粪便样本DNA5μL。
6.根据权利要求4所述的一种基于Sanger法检测幽门螺杆菌S/L-HtrA的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR扩增反应程序参数为：95℃2min；
7.根据权利要求4所述的一种基于Sanger法检测幽门螺杆菌S/L-HtrA的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述PCR产物纯化是使用磁珠法琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。
8.根据权利要求4所述的一种基于Sanger法检测幽门螺杆菌S/L-HtrA的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述测序是基于Sanger双脱氧链终止法进行一代测序。
9.根据权利要求1所述的基于SANGER法检测幽门螺杆菌S/L-HTRA的试剂盒及方法，其特征在于，所述试剂盒的保存方式为环氧冷冻液的环境中；所述环氧冷冻液的制备方法为：
...【技术特征摘要】
1.基于sanger法检测幽门螺杆菌s/l-htra的试剂盒及方法，其特征在于，所述试剂盒包括：
2.根据权利要求1所述的基于sanger法检测幽门螺杆菌s/l-htra的试剂盒及方法，其特征在于，所述pcr扩增引物是：
3.根据权利要求1基于sanger法检测幽门螺杆菌s/l-htra的试剂盒，其特征在于，所述pcr扩增引物seq-f与seq-r在体系内的浓度均为0.2mm。
4.一种基于sanger法检测幽门螺杆菌s/l-htra的方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的一种基于sanger法检测幽门螺杆菌s/l-htra的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述pcr扩增的反应体系包括：2.5×pcr mix 8μl、10μmol/l上游引物(seq-f)1μl、10μmol/l下游引物(seq-r)1μl、去离子水5μl、粪便样本dna...
【专利技术属性】
技术研发人员：焦志军，仇云晓，陈胜兰，强遥，王春香，
申请(专利权)人：康为医学检验实验室泰州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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