本发明专利技术公开了草鱼白介素10启动子区插入或缺失变异的鉴定分析方法，包括以下步骤：步骤1：草鱼IL‑10启动子区插入/缺失分子标记的鉴定，提取草鱼组织总DNA，于‑80℃保存备用；根据GenBank数据库中已报道的草鱼IL‑10启动子序列，设计一对特异性引物IL‑10PF和IL‑10PR进行PCR扩增；步骤2：草鱼IL‑10启动子区插入/缺失分子标记对启动子活性的影响分析；步骤3：草鱼IL‑10启动子区插入/缺失分子标记与草鱼出血病抗性的关联分析。本发明专利技术在草鱼白介素10启动子区鉴定一处影响启动子活性的插入或缺失变异，该变异可用于白介素10启动子活性研究，并且可作为分子标记用于草鱼抗病选育。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学，尤其涉及草鱼白介素10启动子区插入或缺失变异的鉴定分析方法。
技术介绍
1、白介素-10(il-10)是一种由淋巴细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞、上皮细胞等多种细胞分泌的细胞因子。哺乳动物il-10作为一种多效能细胞因子，不仅能够抑制t细胞、单核细胞和巨噬细胞等的活化与多种细胞因子的产生，也能促进b细胞和天然杀伤性细胞的分化和增殖，促进单核细胞和巨噬细胞募集以及肥大细胞集落。另外，il-10还能与其它细胞因子协同维持免疫系统的稳定。
2、与哺乳动物相比，硬骨鱼类il-10的研究起步较晚，近年来河豚、鲤鱼、虹鳟、斑马鱼、鲢鱼和草鱼的il-10基因相继得到克隆鉴定。草鱼il-10cdna全长序列包括60bp的5’端非编码区、402bp的3’端非编码区和540bp的编码区，编码由179个氨基酸组成的草鱼il-10蛋白(gcil-10)。尽管il-10的氨基酸序列在草鱼与哺乳动物之间的相似性仅为44～50％，但gcil-10序列中也存在两个保守的哺乳动物il-10家族基序。目前已证实gcil-10也具有刺激免疫细胞活性和抑制炎症反应等免疫调节功能。因此，免疫或感染草鱼的血清、细胞培养物上清液和肠黏液等生物样品中的il-10水平是评价疫苗免疫效果和鱼体抗感染免疫应答水平的重要指标之一。
3、但是现有的技术中还未有草鱼白介素10启动子区插入或缺失分子标记，对白介素10启动子活性以及草鱼抗病性影响的研究。
技术实现思路
1、1.要解决的技术问题</p>2、本专利技术的目的是为了解决现有技术中还未有草鱼白介素10启动子区插入或缺失分子标记，对白介素10启动子活性以及草鱼抗病性影响研究的问题，而提出的草鱼白介素10启动子区插入或缺失变异的鉴定分析方法。
3、2.技术方案
4、为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
5、草鱼白介素10启动子区插入或缺失变异的鉴定分析方法，包括以下步骤：
6、步骤1：草鱼il-10启动子区插入/缺失分子标记的鉴定，提取草鱼组织总dna，于-80℃保存备用；根据genbank数据库中已报道的草鱼il-10启动子序列，设计一对特异性引物il-10pf和il-10pr进行pcr扩增；
7、步骤2：草鱼il-10启动子区插入/缺失分子标记对启动子活性的影响分析，化学合成含“gagtt”序列重复2次缺失型和“gagtt”序列重复3次插入型的草鱼il-10启动子序列并分别连接至pgl3.0basic载体，获得缺失型pgl3.0-il-10p0-luc以及插入型pgl3.0-il-10p1-luc il-10启动子的荧光素酶报告基因质粒；
8、将含il-10启动子的荧光素酶报告基因质粒与海肾荧光素酶质粒共转染至cik细胞，分析缺失与插入型草鱼il-10启动子以及pgl3.0 basic空载体的荧光素酶活性，以海肾荧光素酶活性作为参照进行标准化；
9、步骤3：草鱼il-10启动子区插入/缺失分子标记与草鱼出血病抗性的关联分析，以il-10杂合型草鱼为亲本获得同时含三种il-10基因型草鱼的全同胞家系子代，在池塘饲养三个月后转移至30℃的循环水养殖系统，暂养7天后使用由本实验室保存的ⅱ型出血病病毒液浸泡感染草鱼，实验共分为三组，每组150尾草鱼；感染后收集所有感病死亡草鱼的鳍条保存于-20℃，在连续7天无草鱼死亡时收集存活草鱼鳍条，提取所有感染出血病后死亡及存活草鱼鳍条的dna，利用引物il-10pf和il-10pr扩增所有草鱼il-10启动子区序列并进行测序，分别统计感染出血病后死亡及存活草鱼中三种白介素10基因型草鱼的数量。
10、优选地，所述步骤1中il-10pf引物序列为5'gtgttattcttgcattgttacatgtaagacgg3'和il-10pr引物序列为5'tcattcagttctctttgttcttggctctttc3'。
11、优选地，所述步骤1中pcr的总体系为20微升，包括1微升dna模板，1微升引物il-10pf，1微升引物il-10pr，10微升2×taq mix和7微升超纯水。pcr反应程序为：反应程序为94℃5min；35个循环的52℃30s，72℃30s,；70℃5min。将pcr产物进行纯化、连接到t载体、转化到大肠杆菌并挑取单克隆进行测序。
12、优选地，所述步骤2中按照双荧光素酶报告分析流程，使用多孔化学发光检测仪分析缺失与插入型草鱼il-10启动子以及pgl3.0basic空载体的荧光素酶活性。
13、3.有益效果
14、相比于现有技术，本专利技术的优点在于：
15、本专利技术中，在草鱼白介素10启动子区鉴定一处影响启动子活性的插入或缺失变异，该变异可用于白介素10启动子活性研究，并且可作为分子标记用于草鱼抗病选育。
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【技术保护点】
1.草鱼白介素10启动子区插入或缺失变异的鉴定分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的草鱼白介素10启动子区插入或缺失变异的鉴定分析方法，其特征在于，所述步骤1中IL-10PF引物序列为5'GTGTTATTCTTGCATTGTTACATGTAAGACGG3'和IL-10PR引物序列为5'TCATTCAGTTCTCTTTGTTCTTGGCTCTTTC3'。
3.根据权利要求1所述的草鱼白介素10启动子区插入或缺失变异的鉴定分析方法，其特征在于，所述步骤1中PCR的总体系为20微升，包括1微升DNA模板，1微升引物IL-10PF，1微升引物IL-10PR，10微升2×Taq mix和7微升超纯水。PCR反应程序为：反应程序为94℃5min；35个循环的52℃30s，72℃30s,；70℃5min。将PCR产物进行纯化、连接到T载体、转化到大肠杆菌并挑取单克隆进行测序。
4.根据权利要求1所述的草鱼白介素10启动子区插入或缺失变异的鉴定分析方法，其特征在于，所述步骤2中按照双荧光素酶报告分析流程，使用多孔化学发光检测仪分析缺失与插入型草鱼IL-10启动子以及pGL3.0 Basic空载体的荧光素酶活性。
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【技术特征摘要】
1.草鱼白介素10启动子区插入或缺失变异的鉴定分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的草鱼白介素10启动子区插入或缺失变异的鉴定分析方法，其特征在于，所述步骤1中il-10pf引物序列为5'gtgttattcttgcattgttacatgtaagacgg3'和il-10pr引物序列为5'tcattcagttctctttgttcttggctctttc3'。
3.根据权利要求1所述的草鱼白介素10启动子区插入或缺失变异的鉴定分析方法，其特征在于，所述步骤1中pcr的总体系为20微升，包括1...
【专利技术属性】
技术研发人员：吕钊，阳鸿，肖调义，王红权，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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