【技术实现步骤摘要】
本专利技术一种属于基因检测及生物传感器检测方法，具体涉及基于杂交链式反应的mirna相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法。
技术介绍
1、microrna(mirna)是一种内源性、高度保守的、短的(长度为18-22个核苷酸)、非编码单链rna，参与转录后基因表达调控。mirna相关的单核苷酸多态性(mirna-snps)包括mirna中特定位点单碱基替换、插入与缺失，对mirna的表达、mirna与信使rna间的相互作用产生重要影响。由于mirna参与调控人类基因组中30％以上的蛋白质编码基因，mirna所发生的微小变异可能对数千条细胞通路产生不可估量的影响，导致基因表达紊乱、多种功能障碍，进而诱发多种疾病与癌症。因此，对人体组织中mirna-snps进行精确定量对临床肿瘤学发展具有重要意义。
2、然而，识别单核苷酸差异的高难度、mirna的序列同源性和小尺寸特性、以及mirna-snps在人体内的低丰度表达等问题对mirna-snps简单、灵敏、特异的定量构成挑战。rna测序是筛选mirna-snps的经典技术之一，但大量的样本消耗、繁琐的程序以及欠佳的灵敏度阻碍其广泛应用。聚合酶链式反应作为传统扩增方法而备受关注，然而严格的操作程序和复杂的实验参数增加了其对操作人员的要求及设备依赖性。因此，迫切需要开发出一种简单、灵敏、低成本的mirna-snps准确定量的生物传感新策略。
3、杂交链式反应作为一种等温核酸扩增技术，因其无酶、高效、成本低、结构灵活等诸多优势，深受科学家们的青睐，被广泛应用于生物传感
技术实现思路
1、专利技术目的：本专利技术的目的在于针对现有mirna-snps检测技术存在的问题，选择非小细胞肺癌潜在生物标志物mir-196a2t作为检测目标物，开发一种基于杂交链式反应的等温核酸扩增方法构建mirna-snps的荧光生物传感器，灵敏度高、简单易操作、快速、低成本、减少对酶及变温设备的依赖性。
2、技术方案：本专利技术所述的基于杂交链式反应的mirna-snps超灵敏荧光传感方法，包括三个步骤：连接反应、消化反应、杂交链式反应。
3、基于杂交链式反应的mirna相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法，所述荧光传感方法包括连接反应、消化反应、杂交链式反应三个步骤：
4、(1)连接反应，杂交链式反应激发链(ab链)的生成：将待测mirna样品加入到连接反应体系中，通过碱基互补配对原理以及splintr连接酶的作用，在35～39℃下进行连接反应，生成mirna互补的dna链，即ab链；优选地，在37℃下进行连接反应；
5、(2)消化反应，步骤(1)所生成的mirna-ab链复合物中mirna的消化：将消化反应缓冲液稀释的rnase h酶加入到步骤(1)反应液中，35～39℃下反应5～30min，使rnase h酶特异性降解mirna-ab链复合物中的mirna，保留ab链；优选地，在37℃下反应5～30min；
6、(3)杂交链式反应，步骤(2)消化保留的ab链激发杂交链式反应：将经退火程序处理的荧光发夹h1和荧光发夹h2加入到步骤(2)反应液中，在16～37℃下孵育0.5～4h，使得激发链ab打开荧光发夹h1，h1所暴露的部分进一步打开荧光发夹h2，h2所暴露的部分再进一步打开荧光发夹h1，进而生成不同长度的dna双链。其中，荧光发夹h1中的fam荧光基团与荧光发夹h2中的tamra荧光基团相互靠近，发生荧光共振能量转移。
7、所述的基于杂交链式反应的mirna相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法，步骤(1)中，所述连接反应体系由a链、b链、splintr连接酶、连接反应缓冲液组成；在35～39℃下孵育5～30min，splintr连接酶连接a链与b链的相邻接头，生成ab链；其中，连接反应缓冲液含有tris-hcl、mgcl2、atp、dtt，ph7.0～8.0；a链的dna序列为：gtaactcag；所述b链的dna序列为：*acagtttcttgt，其中*代表的是磷酸基团修饰；所述ab链的dna序列为：gtaactcagacagtttcttgt。优选地，在37℃下进行连接反应；连接反应缓冲液ph7.5。
8、所述的基于杂交链式反应的mirna相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法，步骤(2)中，所述消化反应缓冲液含有tris-hcl、kcl、mgcl2、dtt，ph7.3～9.3。优选地，消化反应缓冲液ph8.3。
9、所述的基于杂交链式反应的mirna相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法，步骤(3)中，所述退火程序优选为95℃，10min+92.5℃，2min+90.0℃，2min+87.5℃，2min+85.0℃，2min+82.5℃，2min+80.0℃，2min+77.5℃，2min+75.0℃，2min+72.5℃，2min+70.0℃，2min+67.5℃，2min+65.0℃，2min+62.5℃，2min+60.0℃，2min+57.5℃，2min+55.0℃，2min+52.5℃，2min+50.0℃，2min+47.5℃，2min+45.0℃，2min+42.5℃，2min+40.0℃，2min+37.5℃，2min+35.0℃，2min+32.5℃，2min+30.0℃，2min+27.5℃，2min+25.0℃，2min，退火完成后将发夹置于4℃保存。
10、所述的基于杂交链式反应的mirna相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法，步骤(3)中，所述荧光发夹h1的dna序列为：agaaactgtctgagttacgttcttgt(fam)aactcagaca；
11、荧光发夹h2的dna序列为：
12、gtaactcagacagtttcttgtct(tamra)gagttacaagaac。
13、所述的基于杂交链式反应的mirna相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法在制备非小细胞肺癌诊断试剂盒中的应用。
14、所述的应用，所述诊断试剂盒检测的待测mirna为非小细胞肺癌潜在生物标志物mir-196a2t。
15、所述的应用，将待测mir-196a2t和/或mir-196a2c作为待测mirna样品使用所述的方法进行反应，反应结束后，测其荧光光谱。
16、检测非小细胞肺癌生物标志物mir-196a2t的诊断试剂盒，包含rnase h酶、荧光发夹h1、荧光发夹h2、a链、b链、splintr连接酶、连接反应缓冲液、消化反应缓冲液；
17、荧光发夹h1的dna序列为：agaaactgtctgagttacgttcttgt(fam)aactcagaca；荧光发夹h2的dna序列为：gtaact本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于杂交链式反应的miRNA相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法，其特征在于，所述荧光传感方法包括连接反应、消化反应、杂交链式反应三个步骤：
2.根据权利要求1所述的基于杂交链式反应的miRNA相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法，其特征在于，步骤(1)中，所述连接反应体系由A链、B链、SplintR连接酶、连接反应缓冲液组成；在35～39℃下孵育5～30min，SplintR连接酶连接A链与B链的相邻接头，生成AB链；其中，连接反应缓冲液含有Tris-HCl、MgCl2、ATP、DTT，pH7.0～8.0；A链的DNA序列为：GTAACTCAG；所述B链的DNA序列为：*ACAGTTTCTTGT，其中*代表的是磷酸基团修饰；所述AB链的DNA序列为：GTAACTCAGACAGTTTCTTGT。
3.根据权利要求1所述的基于杂交链式反应的miRNA相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法，其特征在于，步骤(2)中，所述消化反应缓冲液含有Tris-HCl、KCl、MgCl2、DTT，pH7.3～9.3。
4.根据权利要求1所述的基于杂交链式反应的
5.权利要求1～4中任意一种所述的基于杂交链式反应的miRNA相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法在制备非小细胞肺癌诊断试剂盒中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述诊断试剂盒检测的待测miRNA为非小细胞肺癌潜在生物标志物miR-196a2T。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将待测miR-196a2T和/或miR-196a2C作为待测miRNA样品使用权利要求1～4中任意一项所述的方法进行反应，反应结束后，测其荧光光谱。
8.一种检测非小细胞肺癌生物标志物miR-196a2T的诊断试剂盒，其特征在于，包含RNase H酶、荧光发夹H1、荧光发夹H2、A链、B链、SplintR连接酶、连接反应缓冲液、消化反应缓冲液；
9.根据权利要求8所述的诊断试剂盒，其特征在于，连接反应缓冲液含有Tris-HCl、MgCl2、ATP、DTT，pH7.0～8.0。
10.根据权利要求8所述的诊断试剂盒，其特征在于，消化反应缓冲液含有Tris-HCl、KCl、MgCl2、DTT，pH7.3～9.3。
...【技术特征摘要】
1.基于杂交链式反应的mirna相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法，其特征在于，所述荧光传感方法包括连接反应、消化反应、杂交链式反应三个步骤：
2.根据权利要求1所述的基于杂交链式反应的mirna相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法，其特征在于，步骤(1)中，所述连接反应体系由a链、b链、splintr连接酶、连接反应缓冲液组成；在35～39℃下孵育5～30min，splintr连接酶连接a链与b链的相邻接头，生成ab链；其中，连接反应缓冲液含有tris-hcl、mgcl2、atp、dtt，ph7.0～8.0；a链的dna序列为：gtaactcag；所述b链的dna序列为：*acagtttcttgt，其中*代表的是磷酸基团修饰；所述ab链的dna序列为：gtaactcagacagtttcttgt。
3.根据权利要求1所述的基于杂交链式反应的mirna相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法，其特征在于，步骤(2)中，所述消化反应缓冲液含有tris-hcl、kcl、mgcl2、dtt，ph7.3～9.3。
4.根据权利要求1所述的基于杂交链式反应的mirna相关单核苷酸多态性超灵敏荧光传感方法，其特征在于，步骤(3)中，所述荧光发夹h1的dna...
【专利技术属性】
技术研发人员：李昺之，赵芙蓉，赵文涛，谢思盈，苏丰丽，尚朝阳，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：
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