【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因检测，更具体的说是涉及一种牛呼吸道合胞体病毒rt-raa检测引物和探针、试剂盒及应用。
技术介绍
1、牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus，brsv)属于副黏病毒科肺病毒亚科肺病毒属，单分子负链rna病毒目，是具有非分段、单链、负股rna基因组的包膜病毒。brsv基因组包含10个开放的阅读框用于编码蛋白质。brsv的f蛋白含有574个氨基酸，并且在不同的brsv分离株之间高度保守，不同菌株的部分序列分析表明氨基酸和核苷酸变异程度分别为1.8％和0.8％。f蛋白是病毒复制不可缺少的，被合成为非活性前体f0，有研究表明牛、绵羊、山羊等均易感染，但主要发生于集约化养殖的刚断奶犊牛及青年牛。brsv主要在肺部的纤毛气道上皮细胞和ⅱ型肺细胞中复制，并诱发支气管间质性肺炎的轻微病变，上皮细胞坏死，渗出性或增生性肺炎，偶有合胞体细胞。牛呼吸道合胞体病毒自20世纪70年代在欧洲首次发现以来，在世界各地呈广泛流行，目前，欧洲、美洲、非洲和亚洲均有从牛体分离出brsv的报道。2007年我国黑龙江首次分离到brsv。brsv感染在犊牛中的发病率相对较高，可达到60％，而死亡率约为20％，给全球养牛业造成重大经济损失。
2、在brsv的临床检测以及流行病学研究中，目前brsv的诊断方法主要是酶联免疫吸附试验(elisa)和rt-pcr。由于病毒复制低且不稳定，上述方法的灵敏度不足，经常导致假阴性结果。
3、因此，提供一种牛呼吸道合胞体病毒rt-raa检测引物和
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种牛呼吸道合胞体病毒rt-raa检测引物和探针、试剂盒及应用。
2、重组酶介导核酸等温扩增技术(reverse transcription recombinase aidamplification，rt-raa)是在恒温条件下利用重组酶-引物复合体、单链结合蛋白打开dna双链，在dna聚合酶作用下完成核酸扩增，通过引入探针并分析荧光信号可以实现对rt-raa反应过程的实时监测。rt-raa具备快速简便、特异、灵敏好等优点，相比于其他检测方法，在实际的临床应用中独具优势。因此，本专利技术针对brsv f基因设计引物及探针，首次建立brsv的rt-raa检测方法，灵敏性高、特异性强。
3、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
4、一种牛呼吸道合胞体病毒rt-raa检测引物和探针，所述引物和探针序列如下：
5、brsv f1：5’-tgtcaagtaatgttcaaatagtyaggcaac-3’；seq id no.1；
6、brsv r1：5’-caataccacccacgatctgtcctagttaag-3’；seq id no.2；
7、probe：tatttatggagttatagacaccccctgttggaaactacaca cctctc；seq id no.7；
8、在探针5’端第29位碱基后加入标记荧光报告基团fam，在探针3’端第16位碱基后加入荧光淬灭基团bhq，在探针5’端第30位碱基和第31位碱基之间标记thf，3’端进行c3-spacer阻断修饰。
9、进一步，所述的牛呼吸道合胞体病毒rt-raa检测引物和探针在制备检测brsv试剂中的应用。
10、进一步，一种牛呼吸道合胞体病毒rt-raa检测试剂盒，包括所述的牛呼吸道合胞体病毒rt-raa检测引物和探针。
11、进一步，所述的牛呼吸道合胞体病毒rt-raa检测试剂盒在检测brsv中的应用。
12、进一步，一种非诊断目的用于brsv的检测方法，包括以下步骤：
13、(1)收集待测试组织样品，提取病毒核酸为模板；
14、(2)利用所述的牛呼吸道合胞体病毒rt-raa检测引物和探针或所述的试剂盒进行rt-raa反应；
15、(3)结果判定：有典型的扩增曲线出现，出峰时间≤18min时，说明样品中有brsv；未出现典型的扩增曲线，或出峰时间>18min时，说明样品中没有brsv。
16、进一步，所述rt-raa反应条件为39℃反应20min。
17、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种牛呼吸道合胞体病毒rt-raa检测引物和探针、试剂盒及应用，根据brsv的f基因片段保守区域设计引物和探针，并构建了基于该病毒f基因的重组质粒标准品pbrsv-f。建立brsv重组酶介导等温核酸扩增技术(rt-raa)，20min内39℃恒温即可完成检测。并应用该方法对常见牛源病毒如传染性牛鼻气管炎病毒(ibrv)、牛副流感病毒3型(bpiv3)、牛病毒性腹泻病毒(bvdv)、牛轮状病毒(brv)、牛呼吸道合胞体病毒(brsv)进行检测，结果表明除brsv外，该方法对其他病毒无交叉反应，均为阴性，特异性较好。将重组质粒标准品pbrsv-f，经体外转录为标准品rna；稀释为108拷贝/μl～100拷贝/μl后作为模板，检出最低拷贝限至102拷贝/μl，与rt-pcr相比，灵敏度高100倍；批间重复试验、批内重复试验后结果表明该方法具有良好的重复性。采用该方法对40份牛源临床样品进行检测，阳性率为7.5％(3/40)，检测结果与rt-pcr一致。本试验首次建立的brsv实时荧光rt-raa检测方法简便、高效、特异、灵敏，为brsv的临床筛查提供可行技术。
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1.一种牛呼吸道合胞体病毒RT-RAA检测引物和探针，其特征在于，所述引物和探针序列如下：
2.权利要求1所述的牛呼吸道合胞体病毒RT-RAA检测引物和探针在制备检测BRSV试剂中的应用。
3.一种牛呼吸道合胞体病毒RT-RAA检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的牛呼吸道合胞体病毒RT-RAA检测引物和探针。
4.权利要求3所述的牛呼吸道合胞体病毒RT-RAA检测试剂盒在检测BRSV中的应用。
5.一种非诊断目的用于BRSV的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的一种非诊断目的用于BRSV的检测方法，其特征在于，所述RT-RAA反应条件为39℃反应20min。
【技术特征摘要】
1.一种牛呼吸道合胞体病毒rt-raa检测引物和探针，其特征在于，所述引物和探针序列如下：
2.权利要求1所述的牛呼吸道合胞体病毒rt-raa检测引物和探针在制备检测brsv试剂中的应用。
3.一种牛呼吸道合胞体病毒rt-raa检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的牛呼吸道合胞体病毒rt-raa检测...
【专利技术属性】
技术研发人员：张志强，侯冠欣，李永慧，史秋梅，吴同垒，高光平，
申请(专利权)人：河北科技师范学院，
类型：发明
国别省市：
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