【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞病理学分析领域，具体涉及一种包埋模具及类器官/细胞球预包埋方法。
技术介绍
1、3d培养模型(类器官/细胞球)是细胞培养技术的一个新的创新,随着新型支架专利技术与应用及细胞成像和分析系统的日新月异，3d细胞培养以其更贴和人体内部细胞生长方式而获得传统2d细胞培养所没有的优势,已在精准医学、基础研究和再生医学等领域崭露头角。其中基于精准预测药物治疗反应对保护人类生命健康安全具有重要意义。为了避免动物实验固有的物种间差异性和局限性，提高药物敏感性实验通量，人体生理功能直接相关的体外模型起到至关重要的作用。
2、对于3d培养模型而言，对其内部结构的组织病理学分析鉴定及其重要，通过组织学切片、染色可以了解其微观结构，探测其表面标志物，探究其与来源组织的相似度。然而，对3d培养物进行病理学分析缺乏有效的分析方法。3d培养模型和细胞学样本都有其共同的特点，样本珍贵，数量有限，在病理学分析时经常遇到难以切片的挑战。特别是肿瘤类器官，培养周期长，所需试剂昂贵，在初期培养未进行扩增时，依据肿瘤样本(细针穿刺活检、肿瘤小体积样本等)消化的所获得的细胞量，可能难以满足大规模培养，只能先进行初代培养，随后传代扩增培养。有时在原代培养类器官时肿瘤细胞数量可能只够24孔细胞培养板的1-3个孔，其中所含类器官数量较少，只能取用少量的类器官来进行组织学分析鉴定，而少量类器官的组织病理学包埋对研究人员而言是有挑战性的。
3、现有的3d培养物病理学分析方法存在的问题有：
4、1.类器官在培养板上培养，体积小，直
5、2.目前关于对类器官包埋缺乏合适的预包埋模具。
6、3.据已有文献报道，研究人员通常使用琼脂糖溶液等包埋胶对类器官进行包埋，但是在琼脂糖溶液包埋时容易凝固，导致类器官悬浮在琼脂糖块中，未能聚集到一个平面，在切片时只能切到少数类器官，甚至切不到类器官，最终导致实验失败。
7、4.据目前已有的类器官包埋方法，在对类器官包埋进行组织学分析时，通常需要合并培养板中多个孔的类器官(24孔板)，通过增加类器官的通量提高切片效率。但是在精准医学中对类器官药物敏感性检测时，需要将类器官培养在96孔板甚至384孔板中，单孔类器官的数量通常是很少的，有时需要进行单孔组织学微观分析来评价其药效时，因操作步骤繁多容易造成类器官的丢失最终导致实验失败。
8、5.琼脂糖溶液的配比不同会导致会导致粘稠度不同，导致类器官或者细胞在离心时的沉降率不同。
9、6.将类器官收集至同一个平面后，在琼脂糖凝固后，可能在将其完整的取出时破坏类器官的平面。
10、因此，亟需一种合适的预包埋模具及方便、快捷、经济的包埋方法来解决类器官包埋的难题。
技术实现思路
1、本专利技术是基于专利技术人对以下事实和问题的发现和认识做出的：
2、目前文献当中报道的3d培养物病理学分析方法较少，主要有石蜡直接包埋法，包埋胶预包埋法和包埋胶预包埋离心法。石蜡直接包埋法是指挑选体积稍大、肉眼可见的类器官，在经过脱水透明后，采用离心的方法收集类器官之后，直接加入石蜡直接包埋。此方法适合于体积大，数量多的类器官，并且类器官在操作中极其容易丢失。包埋胶预包埋法通过收集类器官，加入包埋胶提前对类器官进行预包埋，随后进行石蜡包埋。此方法对类器官预包埋，类器官则弥散在包埋胶中，不能聚集在同一个层面，适用于大量的类器官，对于少量的类器官则难以实现，不利于切片。包埋胶预包埋离心法是指3d培养物在包埋胶预包埋之后增加了离心的步骤，可以将类器官聚集在同一个平面，让切片变得方便。此方法的关键在于包埋胶离心的时机，在加入包埋胶后应尽快离心，防止包埋胶在3d培养物未沉降至底面前而凝固，从而导致包埋失败；另外预包埋模具的选择也很重要，底面最好是平面，模具的体积不能太大，避免类器官挂壁等造成损失。
3、为了解决上述问题，本专利技术的实施例提出一种包埋模具及类器官/细胞球预包埋方法。
4、本专利技术的包埋模具，包括：包埋本体，所述包埋本体为锥形台形状，包埋本体中心处有包埋孔，包埋孔纵向贯穿包埋本体；包埋盖，所述包埋盖的顶部开口，包埋盖的底部圆周向外延伸有手持部，所述包埋盖与包埋孔的底部开口相配合；注水口，所述注水口开设在包埋本体的顶部；橡胶塞，所述橡胶塞与注水口相配合；分离杆，所述分离杆的直径小于包埋孔的直径，且分离杆的长度不小于包埋孔的深度。
5、可选地，所述包埋模具进一步所述包埋管穿过包埋孔与包埋盖可拆卸连接，包埋盖与包埋管的底部开口相配合。
6、本专利技术的类器官/细胞球预包埋方法，需采用本专利技术实施例的包埋模具实现，包括以下步骤：
7、s1.样本准备；
8、s2.包埋模具准备；
9、s3.包埋胶的准备；
10、s4.预包埋。
11、所述步骤s1样本准备的具体步骤为：
12、(5)在培养板选择类器官/细胞球生长状态良好的孔，弃去旧培养基加入4％多聚甲醛固定30min；
13、(6)用枪头将含有类器官/细胞球的matrigel(基质胶)吹散，并将类器官/
14、细胞球转移进1.5ml的ep管中；
15、(7)在1.5ml的ep管中加入5ul组织染色液，静置30min，让类器官/细胞球着色，防止在后续实验中丢失样本；
16、(8)将类器官/细胞球离心，去除上清后将其转入60℃金属浴备用。
17、所述步骤s2包埋模具准备的具体步骤为：
18、(1)向包埋本体的注水口中注入60℃热水，盖上橡胶塞；
19、(2)将包埋孔底部扣紧包埋盖，加入抗粘连润洗液润洗，抗粘连润洗液为含有0.1-5％bsa的pbs溶液；
20、(3)将组装好的包埋本体放入50ml离心管中待用。
21、所述步骤(2)替换为：将包埋管竖直插入包埋孔中，包埋管底部扣紧包埋盖。
22、所述步骤s3包埋胶的准备步骤为：称量琼脂糖粉末，将其加入100ml的超纯水中，微波炉加热使其溶解，配制成1％-5％琼脂糖溶液，将其部分分装在10支1ml的ep管中，室温保存。
23、所述步骤s4预包埋的具体步骤为：
24、(1)使用前取出1ml琼脂糖溶液放入100℃金属浴中预热融化，琼脂糖融化后将金属浴调整至60℃，降至该温度20min后将琼脂糖溶液转移至类器官/细胞球中；
25、(2)再将含有类器官/细胞球的琼脂糖溶液加入至包埋模具中；
26、(3)迅速将包埋模具离心3min；
27、(4)离心后将包埋模具从50ml离心管取出，转移至4℃冰箱静置10min，使琼脂制糖完全冷却；
28、(5)琼脂糖凝固后，将包埋模具进行拆卸，打开包埋盖，使用分离杆将琼脂块轻轻推出；
29、(6)对琼本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种包埋模具，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的包埋模具，其特征在于，所述包埋模具进一步包括包埋管，所述包埋管穿过包埋孔与包埋盖可拆卸连接，包埋盖与包埋管的底部开口相配合。
3.一种类器官/细胞球预包埋方法，其特征在于，所述预包埋方法需采用权利要求1或2任一项所述的包埋模具实现，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的类器官/细胞球预包埋方法，其特征在于，所述步骤S1样本准备的具体步骤为：
5.根据权利要求3所述的类器官/细胞球预包埋方法，其特征在于，所述步骤S2包埋模具准备的具体步骤为：
6.根据权利要求5所述的类器官/细胞球预包埋方法，其特征在于，所述步骤(2)替换为：将包埋管竖直插入包埋孔中，包埋管底部扣紧包埋盖。
7.根据权利要求6所述的类器官/细胞球预包埋方法，其特征在于，所述步骤S3包埋胶的准备步骤为：称量琼脂糖粉末，将其加入100ml的超纯水中，微波炉加热使其溶解，配制成1％-5％琼脂糖溶液，将其部分分装在10支1ml的EP管中，室温保存。
8.根据权利要求7所述的类器
...【技术特征摘要】
1.一种包埋模具，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的包埋模具，其特征在于，所述包埋模具进一步包括包埋管，所述包埋管穿过包埋孔与包埋盖可拆卸连接，包埋盖与包埋管的底部开口相配合。
3.一种类器官/细胞球预包埋方法，其特征在于，所述预包埋方法需采用权利要求1或2任一项所述的包埋模具实现，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的类器官/细胞球预包埋方法，其特征在于，所述步骤s1样本准备的具体步骤为：
5.根据权利要求3所述的类器官/细胞球预包埋方法，其特征在于，所述步骤s2...
【专利技术属性】
技术研发人员：马军，邹锋，
申请(专利权)人：郑州大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：
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