【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于烟草种植，尤其涉及到一种利用雌二醇诱导人工调控转基因烟草叶片落黄的方法。
技术介绍
1、烟草是我国重要的经济作物之一，落黄是烟草叶片生长的最后阶段。作为重要的经济植物，烟叶在其生长后期，也会出现叶片衰老落黄。由于卷烟的品质与烟叶体内代谢产物密切相关，适期收获和烘烤可使烟叶体内代谢产物向着有利于吸味要求方面转化，是提高卷烟品质的关键。目前，叶片衰老领域发现了多个重要基因参与调控，但同时这些基因都无法直接应用于生产，应用范围非常小，因此，寻找基因资源改善烟草叶片落黄成为烟草育种的重要目标。本研究在烟草中发现一个重要的转录因子ntdsr1具有调控叶片落黄的重要功能，通过该基因的雌二醇诱导过量表达获得相应的转基因材料，明确了ntdsr1可以作为重要基因资源调控烟草叶片落黄进程，在应用方面可以对过表达转基因材料在烟草生长后期进行喷洒雌二醇，使转基因材料实现叶片落黄的人工干预。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种雌二醇诱导的人工调控栽培烟草叶片落黄的方法，该方法可以通过雌二醇诱导的方式人为控制烟草落黄时间、落黄叶位，可实现人工精准调控。
2、为了达到上述目的，本专利技术提供了一种利用雌二醇诱导人工调控转基因烟草叶片落黄的方法，所述转基因烟草通过利用农杆菌侵染将目的基因质粒ntdsr1-per8转入野生型烟草中，通过继代培养获得，所述目的基因质粒ntdsr1-per8的核苷酸序列如seq id no：1所示。
3、作为优选，所述目的基因质粒ntdsr1-
4、设计ntdsr1特异引物，利用栽培烟草cdna作为模板进行pcr扩增，扩增后利用1％琼脂糖凝胶对pcr产物进行鉴定；
5、将上述获得的pcr产物稀释50倍作为模板，利用引物对进行pcr扩增，扩增后利用1％琼脂糖凝胶对pcr产物进行鉴定，并切胶回收pcr产物，命名为ntdsr1-接头pcr产物；
6、利用内切酶paci和spei双酶切per8，获得线性化载体，胶回收载体片段，准备连接，并将线性化载体命名为per8-线性化；
7、利用infusion同源重组方法，将ntdsr1-接头pcr产物与per8-线性化连接，并送至公司测序，构建得到目的基因质粒ntdsr1-per8。
8、在上述方案中，ntdsr1的核苷酸序列如seq id no：2所示，其氨基酸序列入seq idno：3所示。
9、作为优选，ntdsr1特异引物包括：
10、ntdsr1f：atggtgcaagaggaaatcag；
11、ntdsr1r：ttaccgaaaggtattccagtcaaaatc；
12、作为优选，引物对包括：
13、ntdsr1-perf：
14、ggcccatacgcgttatggtgcaagaggaaatcag；
15、ntdsr1-perr：
16、gcctggatcgactagttaccgaaaggtattccagtcaaaatcpcr。
17、作为优选，利用转基因烟草cdna作为模板进行pcr扩增的扩增条件为：利用转基因烟草cdna作为模板进行pcr扩增的扩增体系为：green taq mix10μl、10μm ntdsr1f 1μl、10μm ntdsr1r 1μl、template dna 2μl、ddh2o 6μl，总体积20μl；
18、扩增程序为：
19、98℃3min，98℃10s、56℃15s、72℃20s共32个循环，72℃5min，25℃24h；
20、利用引物对进行pcr扩增的扩增体系为：green taq mix 10μl、10μmntdsr1-perf1μl、10μm ntdsr1-perr 1μl、template dna 2μl、ddh2o 6μl，总体积20μl；
21、扩增程序为：
22、98℃3min，98℃10s、56℃15s、72℃20s共32个循环，72℃5min，25℃24h。
23、作为优选，利用infusion同源重组方法具体程序为：
24、infusion重组酶1μl，ntdsr1-接头pcr产物2μl，per8-线性化22μl，在pcr仪中于50℃下反应15min，取出反应产物，转化至大肠杆菌dh5a中。
25、本专利技术提供了一种雌二醇在诱导人工调控转基因烟草叶片落黄方法中的应用。
26、作为优选，所述转基因烟草通过利用农杆菌侵染将目的基因质粒ntdsr1-per8转入野生型烟草中，通过继代培养获得，所述目的基因质粒ntdsr1-per8的核苷酸序列如seqid no：1所示。
27、本专利技术提供了一种根据上述任一项技术方案所述的方法或上述任一项技术方案所述的应用，对于生长60-80天的烟草，通过喷洒20-30μm/1l的雌二醇工作液，可有效实现人工调控的烟草叶片落黄。
28、作为优选，20-30μm/1l的雌二醇工作液通过以下方法制备得到：
29、分别将2或3ml雌二醇母液加入到1l水中，然后再加入100μl吐温-20制备得到；
30、其中，雌二醇母液通过以下方法制备得到：
31、称取雌二醇粉末0.136g，溶解在50ml无水乙醇中，制备得到母液浓度为10mm的雌二醇母液
32、与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果在于：
33、本专利技术提供了一种雌二醇诱导的人工调控栽培烟草叶片落黄的方法，该方法可以通过雌二醇诱导的方式人为控制烟草落黄时间、落黄叶位，可实现人工精准调控。
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1.一种利用雌二醇诱导人工调控转基因烟草叶片落黄的方法，其特征在于，所述转基因烟草通过利用农杆菌侵染将目的基因质粒NtDSR1-PER8转入野生型烟草中，通过继代培养获得，所述目的基因质粒NtDSR1-PER8的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目的基因质粒NtDSR1-PER8通过下述方法构建得到：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，NtDSR1特异引物包括：
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，引物对包括：
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，利用转基因烟草cDNA作为模板进行PCR扩增的扩增体系为：Green Taq Mix 10μL、10μM NtDSR1F1μL、10μM NtDSR1R 1μL、TemplateDNA 2μL、ddH2O 6μL，总体积20μL；
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，利用infusion同源重组方法具体程序为：
7.雌二醇在诱导人工调控转基因烟草叶片落黄方法中的应用。
8.根
9.根据权利要求1-6任一项所述的方法或权利要求7或8所述的应用，其特征在于，对于生长60-80天的烟草，通过喷洒20-30μM/1L的雌二醇工作液，可有效实现人工调控的烟草叶片落黄。
10.根据权利要求9所述的方法或应用，其特征在于，20-30μM/1L的雌二醇工作液通过以下方法制备得到：
...【技术特征摘要】
1.一种利用雌二醇诱导人工调控转基因烟草叶片落黄的方法，其特征在于，所述转基因烟草通过利用农杆菌侵染将目的基因质粒ntdsr1-per8转入野生型烟草中，通过继代培养获得，所述目的基因质粒ntdsr1-per8的核苷酸序列如seq id no：1所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目的基因质粒ntdsr1-per8通过下述方法构建得到：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，ntdsr1特异引物包括：
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，引物对包括：
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，利用转基因烟草cdna作为模板进行pcr扩增的扩增体系为：green taq mix 10μl、10μm ntdsr1f1μl、10μm ntdsr1r 1μl、templatedna 2μl...
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