【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及可用于例如在储存期间提高酶的稳定性的方法和组合物。使用本专利技术的方法和组合物，酶活性随着时间的推移而保持，从而允许更长的储存。
技术介绍
1、患有终末期肾病(end stage kidney disease，eskd)或严重急性肾衰竭(severeacute kidney failure)的患者可以接受透析(血液透析或hd、或腹膜透析或pd)以取代肾功能。常规透析是耗时的，而且废物分子和多余水的去除是不充分的，这严重导致了生活质量差、严重的健康问题和高死亡率(每年15-20％)。治疗成本非常高。
2、在常规透析中，患者流体通常相对于透析流体(称为透析液)进行透析，然后将该透析液废弃。在该过程期间，来自患者流体的废物溶质通过扩散和/或对流(通常通过膜如半透膜)向透析液移动。透析液的这种“单次通过”使用对基础设施要求、治疗成本以及透析机的尺寸和便携性都有重大意义。因此，希望减少透析流体的体积。在微型化工作中，患者流体对相对少量的透析流体进行透析，该透析液通过从使用过的透析液中去除废物溶质而重复再生和重复使用。透析液的有效再生将减少对大量透析流体的需求，使透析更实际地实施，减少对资源的依赖，并减少废物流。
3、微型人工肾设备将是肾脏替代治疗的重大突破。预计到2025年，全球透析患者人数将达到490万。目前，约85％的透析患者在中心(>96％)或在家中(<4％)使用hd技术。在中心hd需要长期频繁地去医院就诊(每周约3次，每次4h)，而家庭hd提供了更多的灵活性和自主权。然而，现今的家
4、连续或更频繁的hd可以减弱在标准的每周三次hd透析治疗之间的水平衡和尿毒症毒素水平中的大幅波动，这可改善患者预后。更自由的饮食将被允许。通过减少对透析人员和相关基础设施的需求、较少的药物和因合并症减少而减少的住院治疗，将实现显著的成本降低。
5、目前约有15％的透析患者使用pd。此外，该技术将显著受益于透析液可持续再生的微型pd设备，从而大大增强pd功效。通过预防常规pd中技术失败的两个主要原因(复发性感染和腹膜功能丧失)，微型pd设备将进一步显著延长技术生存期。
6、因此，对于透析患者来说，在医院外提供透析的用户友好型可穿戴或便携式透析设备代表巨大飞跃，并将显著提高他们的生活品质。该设备将允许连续或更频繁的透析，这将改善废物溶质和多余流体的去除并因此改善患者健康。不依赖于固定水供应的微型化设计为患者提供了自由和自主性。
7、近年来，已经构造了可以充分去除一些有机废物溶质和废物离子的小型的原型透析设备。然而，到目前为止，还没有去除尿素的适当策略，而尿素是成功实现微型人工肾设备的主要障碍之一。尿素是日产量最高的废物溶质(作为氮代谢的主要废物产物)并且在高血浆浓度下会产生毒性作用。然而，尿素难以结合并且具有低反应性。
8、ep121275a1/us4897200a公开了由聚合的苯乙烯组合物以六步合成顺序形成的茚三酮型吸附剂。在临床相关的尿素浓度下表现出的8小时内尿素结合能力为1.2mmol/g干吸附剂。然而，为了有效的微型化，需要更高的尿素结合能力。
9、wo2017116515a1公开了使用带电膜来改善尿素从透析流体中的分离，并建议使用电氧化分离尿素。这种方法的缺点是产生活性氧物质作为副产物。
10、wo2011102807a1公开了环氧化物覆盖的基材。环氧化物可以用于从溶液中回收溶质。它们还被用于固定尿素酶，这有助于尿素的处理。wo2016126596还使用了非常不同的基材，即还原的氧化石墨烯。虽然显示出高的尿素结合能力，但被捕获的尿素不到初始尿素浓度的15％。
11、酶生产和后期使用中的一个关键因素是在长期储存期间保证特定活性。酶活性的保持可以受到酶储存的结构稳定性、储存温度(由于变性引起的酶结构变化)、ph(极端ph值可以使酶变性，并且酶上的催化位点可以对酸性或碱性基团的质子化程度敏感)的影响。酶的稳定性还可以受到氧化的影响，氧化可能是不可逆的并且可能影响许多氨基酸侧基的化学状态，这可能导致酶活性降低。
12、在酶中最常见的20种氨基酸中，有几种可以被氧化。最易受影响的氨基酸是具有巯基的那些氨基酸(半胱氨酸、甲硫氨酸)和具有芳香侧链基团的那些氨基酸(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)。此外，组氨酸残基可以被氧化为2-氧代组氨酸和4-oh-谷氨酸酯，而酪氨酸残基被转化为二羟基衍生物、多巴胺(dopa)、硝基酪氨酸、氯酪氨酸和二酪氨酸衍生物。最后，羰基可以进一步与赖氨酸残基的氨基反应，这导致形成分子内或分子间交联，促进蛋白质聚集(v.cecarini et al.,doi:10.1016/j.bbamcr.2006.08.039)。
13、共溶质(如盐、氨基酸、碳水化合物和蛋白质)结构或稳定性之间的关系已被良好描述，但尚未完全理解。尤其是已促进了碳水化合物或多元醇的使用，以通过影响分子的热力学状态，在更宽范围的外部条件(如温度、ph或浓度)下保持蛋白质结构完整性(vanteeffelen et al.,prot.sci.14,2005；2187-1294)。
14、酶通常在葡萄糖的存在下储存，以在冷冻储存或干燥期间保持功能特性。为了控制氧化，可利用广泛工具箱来保持期望的酶还原状态(例如在惰性气氛下或抗氧化剂的存在下储存)。对于与透析相关的酶如尿素酶，其被发现在已知条件下长期储存并不合适(参见例如图1)。对于尿素酶储存，建议低温储存(doi:10.34049/bcc.51.2.4536)。
15、为了能够开发改善的人工肾设备，持续需要改善的尿素去除手段，或者更坚固、具有更长保质期、或者可以在更多不同的条件下(如在室温下)储存的手段。需要在灭菌条件下稳定的可储存的酶组合物。
技术实现思路
1、本专利技术提供了延长酶(特别是水解酶如尿素酶)的保质期的方法和组合物。发现低聚糖有助于提高保质期稳定性。因此，本专利技术提供了用于提高酶的稳定性的方法，其包括以下步骤：i)提供酶；ii)使所述酶与包含低聚糖的储存溶液接触以获得储存组合物，以及iii)任选地干燥所述储存组合物。所述酶可以是水解酶、优选酰胺水解酶、更优选尿素酶。优选地，所述酶具有活性位点，所述活性位点包含镍中心、更优选两个镍中心、甚至更优选双-μ-配体二聚镍中心。储存溶液优选还包含缓冲盐、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂、低温防护剂或血清白蛋白。优选地，所述储存溶液在5.5-8.2范围内的ph下缓冲，和/或所述储存溶液是药学上可接受的溶液。优选地，所述储存溶液包含5-40重量％的低聚糖、更优选10-35重量％、甚至更优选1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于提高酶的稳定性的方法，其包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶是水解酶，优选酰胺水解酶，更优选尿素酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述酶具有活性位点，所述活性位点包含镍中心、优选两个镍中心、更优选双-μ-配体二聚镍中心。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述储存溶液还包含缓冲盐、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂、低温防护剂或血清白蛋白。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述储存溶液缓冲于5.5-8.2范围内的pH缓冲，和/或其中所述储存溶液是药学上可接受的溶液。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述储存溶液包含5-40重量％、优选10-35重量％、更优选15-30重量％、最优选约25重量％的所述低聚糖。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述储存溶液包含约25重量％的所述低聚糖和任选的缓冲盐，优选磷酸盐缓冲盐。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述低聚糖是低聚己糖，优选低聚己酮糖或低聚己醛糖，更优
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述低聚糖的聚合度为2-75，优选为2-20。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述酶是固定化酶。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述储存组合物储存至少25天，其中在所述储存之后所述酶保留其原始活性的至少75％。
12.一种组合物，该组合物包含如权利要求1中所定义的酶和如权利要求1中所定义的低聚糖。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述酶为酰胺水解酶，优选尿素酶，或其中所述低聚糖是低聚己糖，优选低聚己酮糖或低聚己醛糖，更优选低聚己酮糖。
14.一种用于透析设备的筒，其包含根据权利要求12或13所述的组合物。
15.一种用于储存酶的方法，所述方法包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于提高酶的稳定性的方法，其包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶是水解酶，优选酰胺水解酶，更优选尿素酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述酶具有活性位点，所述活性位点包含镍中心、优选两个镍中心、更优选双-μ-配体二聚镍中心。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述储存溶液还包含缓冲盐、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂、低温防护剂或血清白蛋白。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述储存溶液缓冲于5.5-8.2范围内的ph缓冲，和/或其中所述储存溶液是药学上可接受的溶液。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述储存溶液包含5-40重量％、优选10-35重量％、更优选15-30重量％、最优选约25重量％的所述低聚糖。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述储存溶液包含约25重量％的所述低聚糖和任选的缓冲盐，优选磷酸盐缓...
【专利技术属性】
技术研发人员：H·H·J·德容，J·A·W·容，C·G·布吕歇尔，
申请(专利权)人：奈思特基德尼公司，
类型：发明
国别省市：
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