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【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物模型构建,具体涉及一种慢性hbv病毒复制伴肝炎症损伤小鼠模型的构建及应用。
技术介绍
1、慢性乙型肝炎(chb)是世界范围内一种常见的慢性病毒感染,影响约3.5亿人。据报道,乙型肝炎病毒慢性感染往往导致肝炎,肝纤维化,肝硬化、肝癌等危害相当严重的疾病,持续的高乙肝病毒(hbv)复制与代偿性肝硬化和肝细胞癌(hcc)发展的风险增加相关。目前临床上关于慢性hbv感染的治疗药物主要分为两大类:核苷类药物干扰素,核苷类药物如恩替卡韦,替诺福韦,但所述药物仅能在一定程度上抑制病毒复制且容易引起病毒耐药突变,而常规干扰素-α(ifn-α)及聚乙二醇化ifn-α只对部分患者(应答率不足30%)有效。因此,当前乙型肝炎病毒仍在严重的威胁我国人民生命健康,仍是本领域面临的一个严重的公共卫生问题。
2、研究显示,hbv是一种有包膜的dna病毒,属于肝病毒科。包膜包围着一个二十面体核衣壳,它包含着一个部分双链、松弛的环状dna(rcdna)基因组。目前hbv确切的致病机理仍不清楚,其中一个重要的影响因素是目前慢性hbv复制模型缺乏肝脏炎症,制约了hbv感染免疫发病机理的研究,这个原因在很大程度上限制了相关的医学研究进展,是肝组织内免疫研究的瓶颈问题。因此,建立生物学背景清晰、可供模拟人类肝病过程、又易于获取、经济适用的实验模型显得非常迫切,其中包括小动物模型,一个合适的实验模型不仅有利于对其感染机制进行研究,也有助于研发疫苗及更加有效的治疗药物。
3、现有技术已有公开针对hbv研究建立的动物感染模型,然而,现
4、目前hbv复制模型主要包括hbv转基因鼠模型和hbv转染小鼠模型。hbv转基因模型产生了具有传染性的hbv病毒粒子,在形态上与人源性病毒粒子无法区分。虽然hbv具有免疫耐受性,由于其基因组整合在小鼠基因组中,因此不能自发清除,且在hbv转基因小鼠中没有观察到肝损伤,表明hbv本身不具有细胞病变性。使用hdi法将低剂量的腺病毒载体会导致持续的hbv感染,但是对于肝脏炎症未进行进一步的阐述。采用高压水动力法转染pt-mcs-hbv1.3质粒在b10.d2小鼠建立了hbv急性转染小鼠模型,但是持续时间短(少于15天);在balb/c中则只能构建急性模型(病毒抗原1个月内清除);且各模型小鼠肝脏炎症的变化情况尚未见报道,制约了hbv感染免疫发病机理的研究,是肝组织内免疫研究的瓶颈问题之一。
5、综上所述,现有技术基于高压水动力法构建的慢性hbv病毒复制伴肝脏炎症损伤小鼠模型仍有待进一步探究和优化。
技术实现思路
1、鉴于上述不足,本专利技术提出了一种慢性hbv病毒复制伴肝炎症损伤小鼠模型的构建及应用。本专利技术的目的在于通过构建一种伴肝脏免疫炎症的慢性hbv感染模型用于免疫发病机理的研究,以进一步获得理想的乙型肝炎病毒慢性转染模型。通过观察小鼠2、3、4、5周的病毒学指标以及alt,对肝组织进行he染色。结果显示注射后5周c57 bl/6j小鼠慢性化成模率可达90%,且此模型小鼠4周时肝组织汇管区有明显炎症细胞浸润。
2、本专利技术是通过如下技术手段实现的:
3、一种慢性hbv病毒复制伴肝炎症损伤小鼠模型的构建,包括:
4、(1)制备paav-hbv1.2质粒:
5、paav-hbv1.2质粒(基因序列nt1400~nt3182/1~nt1987)是一种具有hbv1.2的超基因组dna的hbv全表达质粒,其载体为腺相关病毒载体paav。
6、(2)高压水动力法造模:
7、取spf级雄性c57 bl/6j小鼠,将6μgpaav/hbv1.2质粒溶于8-10%(体积/小鼠体重)的pbs溶液中,快速转染实验鼠;以注射同体积的pbs小鼠作为对照;
8、(3)监测病毒学指标在小鼠中持续存在的情况,评估慢性化造模成功与否;检测乙肝表面抗原(hbsag)是否成阳性,以确定转染成功与否;在转染质粒5周后hbsag仍阳性者,确定为hbv慢感染成功模型。
9、(4)监测alt以及对肝组织he染色评估肝损伤情况。
10、进一步地,本次造模使用的质粒剂量为6ug,比传统使用10ug剂量造模的病毒持续时间更久。
11、进一步地,所述hbv基因组dna质粒为paav-hbv1.2质粒,所述载体质粒为paav质粒。
12、进一步地,所述hbv基因组dna质粒的构建方法为:将hbv基因组dna构建入载体质粒后获得,具体构建方法可参见huang等huang lr,wu hl,chen pj,chen ds.animmunocompetent mouse model for the tolerance ofhuman chronic hepatitis bvirus infection.proc natl acad sci u s a.2006;103:17862-7。
13、进一步地,所述paavhbv1.2质粒中hbv基因组dna的参考序列为nt1400~nt3182/1~nt1987。
14、进一步地,所述paav-hbv1.2质粒由如下方法制取:
15、(1)质粒转化
16、①将质粒10ul,加入到溶解的感受态细胞(大肠杆菌)中,冰浴30min;
17、②冰浴时准备lb固体平板:将lb固体培养基放在微波炉中中火融化,稍作静置处理后按照amp:培养基=1:1000的比例,加入100ulamp,混合均匀后将培养基倒入培养皿中(每个培养皿中倒适量即可),静置待其凝固;
18、③冰浴结束后,42℃热激90s,再冰浴2-3min,然后加入800ulalb液体培养基;
19、④将试管放在37℃摇床上220rpm震荡45min;
20、⑤将试管放入离心机,3000rpm离心5min,离心结束后轻轻弃去上清,用试管底残留的液体重悬细胞;
21、⑥取50μl细胞液涂在含有amp的lb固体平板上,37℃倒置培养过夜;
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1.一种慢性HBV病毒复制伴肝炎症损伤小鼠模型的构建方法,包括:
2.根据权利要求1所述的构建方法,包括:
3.根据权利要求1所述的构建方法,其中:
4.根据权利要求3所述的构建方法,其中:
5.根据权利要求1所述的构建方法,其中:
6.根据权利要求5所述的构建方法,其中:
7.一种根据权利要求1~6所述任一构建方法构建的慢性HBV病毒复制伴肝炎症损伤小鼠模型的应用,包括:
【技术特征摘要】
1.一种慢性hbv病毒复制伴肝炎症损伤小鼠模型的构建方法,包括:
2.根据权利要求1所述的构建方法,包括:
3.根据权利要求1所述的构建方法,其中:
4.根据权利要求3所述的构建方法,其中...
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