【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体为一种利用crispr-cas12a体系可视化检测副溶血弧菌和溶藻弧菌的方法。
技术介绍
1、副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus)和溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)是海水养殖动物中的主要细菌性致病菌。广泛存在于鱼类、虾类、贝类等水生动物中。副溶血性弧菌和溶藻弧菌在水产养殖环境中的存在，可以直接引起养殖动物发病，如烂鳃病、烂尾病等，死亡率高，流行面广。同时也会导致养殖动物体质下降，从而继发性感染其他病原，给水产养殖业带来经济损失。因此，对副溶血性弧菌和溶藻弧菌进行快速、准确的检测，是有效控制其流行和传播的前提，能够减少水产养殖业的经济损失，保障消费者的健康。
2、crispr(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)规律成簇间隔短回文重复序列以及cas(crispr-associated proteins)crispr相关蛋白构成crispr-cas系统。研究发现crispr-cas系统不仅具有基因编辑能力，还可应用于核酸检测领域。ii类v型cas12a蛋白在crrna引导下，能够特异性识别目标ssdna并切割，并伴随附带切割功能，激活非特异性ssdna的断裂能力。基于此，借助dna探针这种非特异的ssdna片段加入，通过荧光信号的释放提示靶标基因存在，从而推断样品中是否含有待检的病原体。重组酶等温扩增(isothermal recombinase aided amplifi
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种利用crispr-cas12a体系可视化检测副溶血弧菌和溶藻弧菌的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种利用crispr-cas12a体系可视化检测副溶血弧菌和溶藻弧菌的方法，
3、s1.对检测副溶血弧菌和溶藻弧菌基因组中的特异性目的基因片段进行raa扩增；raa扩增所用引物序列包括：
4、raa-f，其核苷酸序列如seq id no.1所示；
5、raa-r，其核苷酸序列如seq id no.2所示；
6、s2.将raa扩增产物加入含crispr-cas12a体系的反应管中孵育，所述的crispr-cas体系包括针对目的基因的特异性crrna、crispr-cas12a蛋白和用于试纸条检测的reporter序列；在crrna的介导下，crispr-cas12a蛋白特异性识别特异性基因片段的扩增片段，并激活核酸酶活性，从而切割两端修饰有fam和biotin的reporter序列，形成fam-ssdna与ssdna-biotin；
7、其中，crrna的序列如seq id no.3所示；
8、s3.fam-ssdna与ssdna-biotin在结合垫修饰有胶体金的抗fam抗体，检测线胶体金聚集显红色，实现对于副溶血弧菌和溶藻弧菌的可视化检测；
9、其中，检测线为t线。
10、优选地，s1中，raa程序为：混匀配置好的反应体系，37℃孵育20min。
11、优选地，s2中，孵育温度为37℃，孵育时间为30min。
12、优选地，所述reporter序列为用于胶体金试纸条检测的reporter，其序列如下：5’-fam-ttttttatttttt-biotin-3’。
13、优选地，s2中，cas12a浓度为1μm，crrna的浓度为300nm，reporter序列的浓度为5μm。
14、优选地，s2中，crispr/cas12a体系的反应温度为37℃，反应时间为30min。
15、优选地，s3中，试纸条能直接观测结果，实现对于副溶血弧菌和溶藻弧菌的可视化检测
16、本专利技术的有益效果如下：
17、本专利技术通过借助raa技术对副溶血弧菌和溶藻弧菌特异性基因片段进行扩增；在crrna的介导下，cas12a可特异性识别扩增产物，并激活核酸酶活性，从而切割两端修饰有fam和biotin的任意碱基序列ssdna(reporter)，形成fam-ssdna片段与ssdna-biotin片段；fam-ssdna和ssdna-biotin能在结合试纸条，由此实现对于副溶血弧菌和溶藻弧菌的检测。该方法操作简单便携，不依赖大型仪器设备，且灵敏度高、特异性强，具有一定的应用前景。
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1.一种利用CRISPR-Cas12a体系可视化检测副溶血弧菌和溶藻弧菌的方法，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的一种利用CRISPR-Cas12a体系可视化检测副溶血弧菌和溶藻弧菌的方法，其特征在于：S1中，RAA程序为：混匀配置好的反应体系，37℃孵育20min。
3.根据权利要求1所述的一种利用CRISPR-Cas12a体系可视化检测副溶血弧菌和溶藻弧菌的方法，其特征在于：S2中，孵育温度为37℃，孵育时间为30min。
4.根据权利要求1所述的一种利用CRISPR-Cas12a体系可视化检测副溶血弧菌和溶藻弧菌的方法，其特征在于：所述reporter序列为用于胶体金试纸条检测的reporter，其序列如下：5’-FAM-TTTTTTATTTTTT-Biotin-3’。
5.根据权利要求1所述的一种利用CRISPR-Cas12a体系可视化检测副溶血弧菌和溶藻弧菌的方法，其特征在于：S2中，Cas12a浓度为1μM，crRNA的浓度为300nM，reporter序列的浓度为5μM。
6.根据权利要求1所述的一种利
7.根据权利要求1所述的一种利用CRISPR-Cas12a体系可视化检测副溶血弧菌和溶藻弧菌的方法，其特征在于：S3中，试纸条能直接观测结果，实现对于副溶血弧菌和溶藻弧菌的可视化检测。
...【技术特征摘要】
1.一种利用crispr-cas12a体系可视化检测副溶血弧菌和溶藻弧菌的方法，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的一种利用crispr-cas12a体系可视化检测副溶血弧菌和溶藻弧菌的方法，其特征在于：s1中，raa程序为：混匀配置好的反应体系，37℃孵育20min。
3.根据权利要求1所述的一种利用crispr-cas12a体系可视化检测副溶血弧菌和溶藻弧菌的方法，其特征在于：s2中，孵育温度为37℃，孵育时间为30min。
4.根据权利要求1所述的一种利用crispr-cas12a体系可视化检测副溶血弧菌和溶藻弧菌的方法，其特征在于：所述reporter序列为用于胶体金试纸条检测的reporter，其序列如下：5’-fam-t...
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