【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，涉及解脂耶氏酵母工程菌株，尤其是一种高水平生产α-亚麻酸的解脂耶氏酵母工程菌株、构建方法和应用。
技术介绍
1、α-亚麻酸(α-linolenic acid，ala，c18:3δ9δ12，δ15)是含有十八个碳原子，三个双键的直链脂肪酸，相对分子质量为278，是人体细胞膜重要构成成分并且是人体必需脂肪酸，在医疗、食品、化妆品等领域被广泛应用。目前国内外生产的α亚麻酸主要来源于苏子(perillafrutescens britt)，但是从植物中提取α-亚麻酸受到诸多因素的限制，比如，植物的生长周期长，生长环境要求高，占地面积大，油含量不高等，因此难以满足人们日益增长的市场需求。
2、微生物发酵法不受季节限制、可大规模生产、产量稳定、质量可靠、发酵所用的材料来源广泛、价格低廉等优势，目前应用解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)是多不饱和脂肪酸生产的研究热点。鉴于解脂耶氏酵母中天然存在的脂肪酸为十八碳二烯酸(la，c18:2)，故以解脂耶氏酵母发酵生产α-亚麻酸需要外源引入δ15去饱和酶基因，其机理参见图1。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种高水平生产α-亚麻酸的解脂耶氏酵母工程菌株、构建方法和应用。
2、本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
3、一种高水平生产α-亚麻酸的解脂耶氏酵母工程菌株，所述菌株是以解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica po
4、进一步地，所述δ15去饱和酶基因来源于桔林油脂酵母lipomyceskononenkoaelkfad15，其序列如seq id no.1所示；
5、所述酰基转移酶为甘油-3-磷酸线基转移酶gpat和/或溶血磷脂酸酰基转移酶lpaat和/或二酰基甘油酰基转移酶dgat；
6、所述二酰基甘油酰基转移酶来源于裂殖壶菌(schizochytrium.sp)scdgat，所述scdgat基因序列如seq id no.2所示；
7、所述甘油-3-磷酸线基转移酶来源于三角褐指藻(phaeodactylum tricornutum)ptgpat，所述ptgpat基因序列如seq id no.3所示；
8、所述溶血磷脂酸酰基转移酶来源于三角褐指藻(phaeodactylum tricornutum)ptlpaat，所述ptlpaat基因序列如seq id no.4所示。
9、如上所述的高水平生产α-亚麻酸的解脂耶氏酵母工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
10、(1)重组质粒puc-intc-δ15des的构建
11、以puc-intc质粒为骨架，在该质粒骨架上插入lkfad15基因表达盒，即得重组质粒puc-intc-δ15des；
12、(2)产α-亚麻酸的基因工程菌株polf-d1的构建
13、将重组质粒puc-intc-δ15des转入尿嘧啶营养缺陷型的解脂耶氏酵母polf中，即得解脂耶氏酵母工程菌株polf-d1；
14、(3)解脂耶氏酵母工程菌株polf-d1(ura-)的制备
15、将解脂耶氏酵母工程菌株polf-d1接种于ypd-5foa固体培养基，待长出单菌落后，在ypd固体培养基中再次划线活化，得到解脂耶氏酵母工程菌株polf-d1(ura-)；
16、(4)重组质粒puc-intf3-dgat的构建
17、以puc-intf3质粒为骨架，在该质粒骨架上插入scdgat基因表达盒，即得重组质粒puc-intf3-dgat；
18、(5)解脂耶氏酵母工程菌株polf-d2的制备
19、将重组质粒puc-intf3-dgat转入解脂耶氏酵母工程菌株polf-d1(ura-)中，即得解脂耶氏酵母工程菌株polf-d2；
20、(6)重组质粒puc-intf3-gpat的构建
21、以puc-intf3质粒为骨架，在该质粒骨架上插入ptgpat基因表达盒，即得重组质粒puc-intf3-gpat；
22、(7)解脂耶氏酵母工程菌株polf-d3的制备
23、将重组质粒puc-intf3-gpat转入解脂耶氏酵母工程菌株polf-d1(ura-)中，即得解脂耶氏酵母工程菌株polf-d3；
24、(8)重组质粒puc-intf3-lpaat的构建
25、以puc-intf3质粒为骨架，在该质粒骨架上插入ptlpaat基因表达盒，即得重组质粒puc-intf3-lpaat；
26、(9)解脂耶氏酵母工程菌株polf-d4的制备
27、将重组质粒puc-intf3-lpaat转入解脂耶氏酵母工程菌株polf-d1(ura-)中，即得解脂耶氏酵母工程菌株polf-d4；
28、(10)重组质粒puc-scp2-gpat-lpaat的构建
29、以puc-scp2质粒为骨架，在该质粒骨架上插入ptgpat基因表达盒和scdgat基因表达盒，即得重组质粒puc-scp2-gpat-lpaat；
30、(11)解脂耶氏酵母工程菌株polf-d5的制备
31、将重组质粒puc-scp2-gpat-lpaat转入解脂耶氏酵母工程菌株polf-d2(ura-)中，即得解脂耶氏酵母工程菌株polf-d5。
32、进一步地，步骤(2)尿嘧啶营养缺陷型的解脂耶氏酵母polf的构建方法为：通过crispr/cas9技术敲除解脂耶氏酵母po1f中的编码尿嘧啶基因；
33、具体构建方法参考按照journal ofagricultural and food chemistry杂志2021年第69卷第46期，13831-13837页，论文名称为“harnessing yarrowia lipolyticaperoxisomes as a subcellular factory forα-humulene overproduction”中记载的方法制得。
34、进一步地，步骤(1)重组质粒puc-intc-δ15des的构建方法为：以带有尿嘧啶遗传标记的puc-intc质粒为骨架，在该质粒骨架上插入δ15去饱和酶基因表达盒。
35、进一步地，步骤(1)中，所述lkfad15基因表达盒启动子为来源于解脂耶氏酵母的pyat启动子、ptef启动子或pfbain启动子中的一种，终止子为来源于解脂耶氏酵母的txpr2t终止子、tlip2t终止子和tcyc1t终止子中的一种；
36、步骤(4)中，所述scdgat基因表达盒启动子为来源于解脂耶氏酵母的pyat启动子、ptef启动子和pfbain启动子中的一种，终止子为来源于解脂耶氏酵母的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高水平生产α-亚麻酸的解脂耶氏酵母工程菌株，其特征在于：所述菌株是以解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica Po1f)为出发菌株，表达Δ15去饱和酶基因，再协同过表达酰基转移酶获得的。
2.根据权利要求1所述的高水平生产α-亚麻酸的解脂耶氏酵母工程菌株，其特征在于：
3.如权利要求1或2所述的高水平生产α-亚麻酸的解脂耶氏酵母工程菌株的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：步骤(2)尿嘧啶营养缺陷型的解脂耶氏酵母Polf的构建方法为：通过CRISPR/Cas9技术敲除解脂耶氏酵母Po1f中的编码尿嘧啶基因；
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：步骤(1)重组质粒PUC-Intc-Δ15DEs的构建方法为：以带有尿嘧啶遗传标记的PUC-Intc质粒为骨架，在该质粒骨架上插入Δ15去饱和酶基因表达盒。
6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：步骤(1)中，所述LKFAD15基因表达盒启动子为来源于解脂耶氏酵母的PYAT启动子、PTEF启动子或
7.如权利要求1或2所述的解脂耶氏酵母工程菌株在生产α-亚麻酸中的应用。
8.利用如权利要求1或2所述的解脂耶氏酵母工程菌株发酵生产α-亚麻酸的方法，其特征在于：所述解脂耶氏酵母工程菌株在以在YNB限氮培养基上发酵生产α-亚麻酸；
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，种子液中活菌数为1.2×108～2.4×108CFU/mL；
...【技术特征摘要】
1.一种高水平生产α-亚麻酸的解脂耶氏酵母工程菌株，其特征在于：所述菌株是以解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica po1f)为出发菌株，表达δ15去饱和酶基因，再协同过表达酰基转移酶获得的。
2.根据权利要求1所述的高水平生产α-亚麻酸的解脂耶氏酵母工程菌株，其特征在于：
3.如权利要求1或2所述的高水平生产α-亚麻酸的解脂耶氏酵母工程菌株的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：步骤(2)尿嘧啶营养缺陷型的解脂耶氏酵母polf的构建方法为：通过crispr/cas9技术敲除解脂耶氏酵母po1f中的编码尿嘧啶基因；
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：步骤(1)重组质粒puc-intc-δ15des的构建方法为：以带有尿嘧啶遗传标记的puc-intc质粒为骨架，...
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