【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于表达α6β4烟碱型乙酰胆碱受体(nachr)的分离的重组细胞及其使用方法。以电子方式提交的参考序列表本申请包含已经以ascii格式电子递交的序列表，并且据此全文以引用方式并入。创建于2022年2月28日的所述ascii副本命名为prd4127wopct1_sl.txt并且大小为24,576字节。
技术介绍
1、烟碱通过作用于烟碱型乙酰胆碱受体(nachr)而具有止痛特性(hone等人，nicotinic acetylcholine receptors in neuropathic and inflammatory pain,febslett.2018年4月；592(7):1045-1062.doi:10.1002/1873-3468.12884)。地棘蛙素(epibatidine)是一种通用的nachr激动剂和强效止痛剂(daly等人，alkaloids from frogskin:the discovery of epibatidine and the potential for developing novel non-opioid analgesics nat prod rep.2000年4月；17(2):131-5.doi:10.1039/a900728h)。此外，泛nachr激动剂abt-594在2期临床试验中显示出对糖尿病性神经病的强大功效。遗憾的是，abt-594具有不可接受的副作用并且其精确的分子靶点尚不清楚(rowbotham等人，arandomized,double-blind,placeb
2、然而，针对人α6β4受体的药物发现是不可能的，因为这些受体在重组细胞系中的表达是难以控制的(yang等人，mysteriousα6-containing nachrs:function,pharmacology,and pathophysiology,acta pharmacologica sinica,2009年6月；30(6):740–751)。
3、仍然需要开发稳健地表达这些受体并可以用于药物发现的细胞系。
技术实现思路
1、本文提供了分离的重组细胞，包含：a)编码α6β4烟碱型乙酰胆碱受体(nachr)的α6亚基的异源核酸；b)编码α6β4nachr的β4亚基的异源核酸；和c)至少一种选自由编码β相关调节蛋白(barp)的异源核酸、编码胆碱o-乙酰转移酶(chat)的异源核酸和编码磺基转移酶家族2b成员1(sult2b1)的异源核酸组成的组的异源核酸。
2、在分离的重组细胞的一个实施方案中，重组细胞包含编码barp的异源核酸、编码chat的异源核酸和编码sult2b1的异源核酸。
3、在分离的重组细胞的另一个实施方案中，重组细胞是哺乳动物细胞。
4、在分离的重组细胞的另一个实施方案中，哺乳动物细胞选自由以下项组成的组：人胚胎肾293t(hek293t)细胞、hek293f细胞、hela细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、nih 3t3细胞、mcf-7细胞、hep g2细胞、幼仓鼠肾(bhk)细胞和cos7细胞。
5、在分离的重组细胞的另一个实施方案中，α6β4nachr的α6亚基包含与seq id no:1的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
6、在分离的重组细胞的另一个实施方案中，α6β4nachr的β4亚基包含与seq id no:2的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
7、在分离的重组细胞的另一个实施方案中，barp包含与seq id no:3的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
8、在分离的重组细胞的另一个实施方案中，chat包含与seq id no:4的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
9、在分离的重组细胞的另一个实施方案中，sult2b1包含与seq id no 5的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
10、本文进一步提供了用于鉴定α6β4nachr的激动剂、拮抗剂或阳性变构调节剂的方法，该方法包括：a)使上述分离的重组细胞与药剂接触；以及b)测定分离的重组细胞的α6β4nachr的活性，其中如果药剂增强该α6β4nachr的活性，则将该药剂鉴定为激动剂或阳性变构调节剂(pam)，并且如果与分离的重组细胞未与药剂接触时的α6β4nachr的活性相比，该药剂降低α6β4nachr的活性，则将该药剂鉴定为拮抗剂。
11、在该方法的另一个实施方案中，步骤b)包括测定分离的重组细胞的钙通量，其中如果与分离的重组细胞未与药剂接触时的钙通量相比，该药剂增强钙通量，则将该药剂鉴定为激动剂。
12、在该方法的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种分离的重组细胞，包含：
2.根据权利要求1所述的分离的重组细胞，其中所述重组细胞包含所述编码BARP的异源核酸、所述编码CHAT的异源核酸序列和所述编码SULT2B1的异源核酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的分离的重组细胞，其中所述重组细胞是哺乳动物细胞。
4.根据权利要求3所述的分离的重组细胞，其中所述哺乳动物细胞选自由以下项组成的组：人胚胎肾293T(HEK293T)细胞、HEK293F细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NIH3T3细胞、MCF-7细胞、Hep G2细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞和Cos7细胞。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的重组细胞，其中所述α6β4nAChR的α6亚基包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的分离的重组细胞，其中所述α6β4nAChR的β4亚基包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的分离的重组细
8.根据权利要求1至7中任一项所述的分离的重组细胞，其中所述CHAT包含与SEQ IDNO:4的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的分离的重组细胞，其中所述SULT2B1包含与SEQID NO:5的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
10.一种用于鉴定α6β4nAChR的激动剂、拮抗剂或阳性变构调节剂的方法，所述方法包括：
11.根据权利要求10所述的方法，其中步骤b)包括测定所述分离的重组细胞的钙通量，其中如果与所述分离的重组细胞未与所述药剂接触时的所述钙通量相比，所述药剂增强所述钙通量，则将所述药剂鉴定为激动剂。
12.根据权利要求10所述的方法，其中步骤b)包括测定所述分离的重组细胞的钙通量和烟碱诱发的钙通量，其中如果与所述分离的重组细胞未与所述药剂接触时的所述钙通量和烟碱诱发的钙通量相比，所述药剂不增强钙通量并增强所述烟碱诱发的钙通量，则将所述药剂鉴定为PAM。
13.根据权利要求10所述的方法，其中步骤b)包括测定所述分离的重组细胞的烟碱诱发的钙通量，其中如果与所述分离的重组细胞未与所述药剂接触时的所述烟碱诱发的钙通量相比，所述药剂降低所述烟碱诱发的钙通量，则将所述药剂鉴定为拮抗剂。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中所述分离的重组细胞在与所述药剂接触之前，在约25℃-35℃下温育约20小时-50小时。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的方法，其中所述药剂是小分子或肽。
16.一种试剂盒，包含(i)根据权利要求1至9中任一项所述的分离的重组细胞，和(ii)使用说明。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种分离的重组细胞，包含：
2.根据权利要求1所述的分离的重组细胞，其中所述重组细胞包含所述编码barp的异源核酸、所述编码chat的异源核酸序列和所述编码sult2b1的异源核酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的分离的重组细胞，其中所述重组细胞是哺乳动物细胞。
4.根据权利要求3所述的分离的重组细胞，其中所述哺乳动物细胞选自由以下项组成的组：人胚胎肾293t(hek293t)细胞、hek293f细胞、hela细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、nih3t3细胞、mcf-7细胞、hep g2细胞、幼仓鼠肾(bhk)细胞和cos7细胞。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的重组细胞，其中所述α6β4nachr的α6亚基包含与seq id no:1的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的分离的重组细胞，其中所述α6β4nachr的β4亚基包含与seq id no:2的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的分离的重组细胞，其中所述barp包含与seq idno:3的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的分离的重组细胞，其中所述chat包含与seq idno:4的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：D·S·布雷特，顾申艳，J·马塔，D·诺兰，W·达维尼，J·林贝里斯，
申请(专利权)人：詹森药业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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