DF-1细胞中EE0.6位点敲除载体和NC_006127.4位点敲除载体制造技术

技术编号：40641085 阅读：6 留言：0更新日期：2024-03-13 21:22

本发明专利技术提供了DF‑1细胞中EE0.6位点敲除载体和NC_006127.4位点敲除载体，属于基因编辑技术领域。本发明专利技术通过设计靶向EE0.6序列的sgRNA和靶向NC_006127.4位点的sgRNA，设计oligo引物，将双链oligo与PX458质粒、PX461连接，获得不同的重组质粒，本发明专利技术还制备了双sgRNA敲除载体，并将不同的重组质粒导入DF‑1细胞中，获得了不同的EE0.6位点和NC_006127.4的敲除载体，并进行了敲除效率验证。结果表明，DF‑1细胞中EE0.6位点敲除载体以及NC_006127.4位点敲除载体构建成功，为DF‑1细胞外源靶基因高效整合奠定了基础。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因编辑，尤其涉及df-1细胞中ee0.6位点敲除载体和nc_006127.4位点敲除载体。

技术介绍

1、crispr/cas9介导的基因编辑在本质上是利用转基因或同源重组等方式对靶基因或转录产物进行敲除、插入和定点突变等精确修饰的基因工程技术。目前crispr/cas9基因编辑技术在哺乳动物中应用比较成熟，因禽类具有卵生的生殖特性，其基因编辑研究进展相对缓慢。禽类胚盘与卵黄紧密相贴，不能体外分离和培养胚盘细胞，所以不能像哺乳动物一样通过传统转基因编辑技术产生基因组定向修饰的个体。

2、随着crispr/cas9技术的开发与应用，虽已有研究成功将基因编辑后的鸡原始生殖细胞导入鸡体内，产生转基因嵌合体鸡模型，然而该系统存在着脱靶率高、同源重组修复效率低下等缺陷，因此禽类准确且简单可行的转基因定向编辑体系仍未有突破性进展，这使得转基因禽类模型难以建立。因此，优化该系统的敲入效率，实现外源靶基因高效整合基因组是目前亟需解决的重要问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，为了解决转基因禽类模型难以建立的问题，本专利技术的目的在于提供构建df-1细胞中ee0.6位点敲除载体以及nc_006127.4位点敲除载体方法，ee0.6和nc_006127.4位点为鸡性染色体安全位点，敲除两位点后，对细胞的维持与分化无影响。

2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：

3、本专利技术提供了一种df-1细胞中ee0.6位点敲除载体，所述df-

4、(1)设计三条靶向ee0.6序列的sgrna，为ee0.6-sg1、ee0.6-sg2、ee0.6-sg3，ee0.6-sg1、ee0.6-sg2、ee0.6-sg3的序列如seq id no.4～seq id no.6所示；

5、(2)根据ee0.6-sg1、ee0.6-sg2、ee0.6-sg3的核酸序列设计oligo引物，将设计合成的oligo引物进行退火和杂交处理，得到双链oligo引物，将双链oligo引物与线性化的质粒载体连接，分别得到ee0.6-sg1、ee0.6-sg2、ee0.6-sg3敲除载体。

6、优选的，所述质粒载体为px458质粒或px461质粒；当质粒载体为px458质粒时，得到px458-ee0.6-sg1、px458-ee0.6-sg2、px458-ee0.6-sg3敲除载体；当质粒载体为px461质粒时，得到px461-ee0.6-sg1、px461-ee0.6-sg2、px461-ee0.6-sg3敲除载体。

7、本专利技术还提供了一种df-1细胞中ee0.6位点双sgrna敲除载体，所述df-1细胞中ee0.6位点双sgrna敲除载体的制备包括如下步骤：

8、(1)以sgrna1-f和sgrna2-r为引物，以pcmv-sgrna-hu6-twinstrep质粒载体为模板扩增出目的片段；所述sgrna1-f和sgrna2-r的序列分别如seq id no.13和seq id no.14所示；

9、(2)将步骤(1)扩增的目的片段插入px458质粒的bbsι位点，得到px458-ee0.6-2sgrna敲除载体。

10、本专利技术还提供了一种敲除ee0.6位点的df-1细胞，将所述的敲除载体中的px458-ee0.6-sg1、px458-ee0.6-sg2、px458-ee0.6-sg3敲除载体或所述的px458-ee0.6-2sgrna敲除载体转中的任意一个敲除载体染至df-1细胞。

11、本专利技术还提供了一种敲除ee0.6位点的df-1细胞，将所述的敲除载体px461-ee0.6-sg1、px461-ee0.6-sg2、px461-ee0.6-sg3中的任意两个敲除载体共同导入df-1细胞。

12、本专利技术还提供了df-1细胞中nc_006127.4位点敲除载体，所述df-1细胞中nc_006127.4位点敲除载体的制备方法包括如下步骤：

13、(1)设计三条靶向nc_006127.4序列的sgrna，为nc_006127.4-sg1、nc_006127.4-sg2、nc_006127.4-sg3，nc_006127.4-sg1、nc_006127.4-sg2、nc_006127.4-sg3的序列如seq id no.1～seq id no.3所示；

14、(2)根据nc_006127.4-sg1、nc_006127.4-sg2、nc_006127.4-sg3的核苷酸序列设计oligo引物，将设计合成的oligo引物进行退火和杂交处理，得到双链oligo，将双链oligo与线性化的质粒载体连接，分别得到nc_006127.4-sg1、nc_006127.4-sg2、nc_006127.4-sg3敲除载体。

15、优选的，所述质粒载体为px458质粒或px461质粒；当质粒载体为px458质粒时，得到px458-ee0.6-sg1、px458-ee0.6-sg2、px458-ee0.6-sg3敲除载体；当质粒载体为px461质粒时，得到px461-nc_006127.4-sg1、px461-nc_006127.4-sg2、px461-nc_006127.4-sg3敲除载体。

16、本专利技术还提供了一种df-1细胞中nc_006127.4位点双sgrna敲除载体，所述df-1细胞中nc_006127.4位点双sgrna敲除载体的制备包括如下步骤：

17、(1)以sgrna1-f和sgrna2-r为引物，以pcmv-sgrna-hu6-twinstrep为模板扩增出目的片段；所述sgrna1-f和sgrna2-r的序列分别为seq id no.13和seq id no.14所示；

18、(2)将步骤(1)扩增的目的片段插入px458质粒的bbsι位点，得到px458-nc_006127.4-2sgrna敲除载体。

19、本专利技术还提供了一种敲除nc_006127.4位点的df-1细胞的制备方法，将所述的px458-nc_006127.4-sg1、px458-nc_006127.4-sg2、px458-nc_006127.4-sg3敲除载体或所述的px458-nc_006127.4-2sgrna敲除载体中的任意一个敲除载体转染至df-1细胞。

20、本专利技术还提供了一种敲除nc_006127.4位点的df-1细胞，将所述的px461-nc_006127.4-sg1、px461-nc_006127.4-sg2、px461-nc_006127.4-sg3中的任意两个敲除载体共同导入df-1细胞。

21、通过采用上述技术方案，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术构建了df-1细胞中ee0.6位点敲除载体以及nc_006127.4位点敲除载体，并利用qrt-pcr检测、western 本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种DF-1细胞中EE0.6位点敲除载体，其特征在于，所述DF-1细胞中EE0.6位点敲除载体的制备包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的敲除载体，其特征在于，所述质粒载体为PX458质粒或PX461质粒；当质粒载体为PX458质粒时，得到PX458-EE0.6-sg1、PX458-EE0.6-sg2、PX458-EE0.6-sg3敲除载体；当质粒载体为PX461质粒时，得到PX461-EE0.6-sg1、PX461-EE0.6-sg2、PX461-EE0.6-sg3敲除载体。

3.一种DF-1细胞中EE0.6位点双sgRNA敲除载体，其特征在于，所述DF-1细胞中EE0.6位点双sgRNA敲除载体的制备包括如下步骤：

4.一种敲除EE0.6位点的DF-1细胞，其特征在于，将权利要求2所述的敲除载体中的PX458-EE0.6-sg1、PX458-EE0.6-sg2、PX458-EE0.6-sg3敲除载体或权利要求3所述的PX458-EE0.6-2sgRNA敲除载体转中的任意一个敲除载体染至DF-1细胞。

5.一种敲除EE0.6

6.一种DF-1细胞中NC_006127.4位点敲除载体，其特征在于，所述DF-1细胞中NC_006127.4位点敲除载体的制备方法包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的敲除载体，其特征在于，所述质粒载体为PX458质粒或PX461质粒；当质粒载体为PX458质粒时，得到PX458-EE0.6-sg1、PX458-EE0.6-sg2、PX458-EE0.6-sg3敲除载体；当质粒载体为PX461质粒时，得到PX461-NC_006127.4-sg1、PX461-NC_006127.4-sg2、PX461-NC_006127.4-sg3敲除载体。

8.一种DF-1细胞中NC_006127.4位点双sgRNA敲除载体，其特征在于，所述DF-1细胞中NC_006127.4位点双sgRNA敲除载体的制备包括如下步骤：

9.一种敲除NC_006127.4位点的DF-1细胞的制备方法，其特征在于，将权利要求7所述的PX458-NC_006127.4-sg1、PX458-NC_006127.4-sg2、PX458-NC_006127.4-sg3敲除载体或权利要求8所述的PX458-NC_006127.4-2sgRNA敲除载体中的任意一个敲除载体转染至DF-1细胞。

10.一种敲除NC_006127.4位点的DF-1细胞，其特征在于，将权利要求7所述的PX461-NC_006127.4-sg1、PX461-NC_006127.4-sg2、PX461-NC_006127.4-sg3中的任意两个敲除载体共同导入DF-1细胞。

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【技术特征摘要】

1.一种df-1细胞中ee0.6位点敲除载体，其特征在于，所述df-1细胞中ee0.6位点敲除载体的制备包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的敲除载体，其特征在于，所述质粒载体为px458质粒或px461质粒；当质粒载体为px458质粒时，得到px458-ee0.6-sg1、px458-ee0.6-sg2、px458-ee0.6-sg3敲除载体；当质粒载体为px461质粒时，得到px461-ee0.6-sg1、px461-ee0.6-sg2、px461-ee0.6-sg3敲除载体。

3.一种df-1细胞中ee0.6位点双sgrna敲除载体，其特征在于，所述df-1细胞中ee0.6位点双sgrna敲除载体的制备包括如下步骤：

4.一种敲除ee0.6位点的df-1细胞，其特征在于，将权利要求2所述的敲除载体中的px458-ee0.6-sg1、px458-ee0.6-sg2、px458-ee0.6-sg3敲除载体或权利要求3所述的px458-ee0.6-2sgrna敲除载体转中的任意一个敲除载体染至df-1细胞。

5.一种敲除ee0.6位点的df-1细胞，其特征在于，将权利要求2所述的敲除载体px461-ee0.6-sg1、px461-ee0.6-sg2、px461-ee0.6-sg3中的任意两个敲除载体共同导入df-1细胞。

6.一种df-1细胞中nc_006127.4位点敲除载体，其特征在于，所述df-1细胞中...

【专利技术属性】
技术研发人员：靳锴，孙国兴，梁佑臣，薛倩，韩威，左其生，牛英杰，陈国宏，李碧春，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：

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