【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，具体涉及一种利用乙酰羟酸合酶制备芳香族α-羟基酮的方法。
技术介绍
1、芳香族α-羟基酮在有机化学及制药行业具有特殊价值，可作为结构原件用于制备结构更为复杂的化合物。例如，抗抑郁药、拟交感神经药物麻黄类生物碱、法尼基转移酶抑制剂(kurasoin a和b)以及抗肿瘤抗生素(olivomycin a和chromomycin)中都存在α-羟基酮结构，因此，开发高效的芳香族α-羟基酮合成方法是制药领域的一个热点。其中，(r)-苯乙酰基甲醇是较为熟知的一种手性芳香族α-羟基酮，是合成神经胺类药物的重要原料，包括去甲麻黄碱、去甲伪麻黄碱、麻黄碱、伪麻黄碱、去甲肾上腺素以及苯基丙醇胺。除此以外，(r)-1-羟基-1-(3-羟基苯基)-2-丙酮可用作合成间羟胺的原料。(r)-1-(2，5-二甲氧基苯基)丁醇是甲氧胺合成原料，甲氧胺可用于预防和治疗急性低血压，也用于药物反应、手术并发症以及肿瘤引起的脑损伤相关的休克。由此可见，开发芳香族类α-羟基酮将有力促进新型神经胺类药物合成。
2、化学合成法合成α-羟基酮涉及高温高压及高危催化剂的使用，同时也面临着混合对映体问题，需要进一步通过手性分离设备从混合物中分离得到纯对映异构体。酶催化因其天然的立体选择性，反应条件温和高效等优势而成为α-羟基酮合成中的有效替代方法。其中硫胺素二磷酸依赖性裂解酶(thdp依赖性裂解酶)这一酶家族被提出用于手性α-羟基酮合成。目前，几种thdp裂解酶已被开发用于催化醛与丙酮酸缩合，合成结构多样化的α-羟基酮化合物。具体地包括丙酮酸脱羧
技术实现思路
1、本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的目的在于提供一种利用乙酰羟酸合酶制备芳香族α-羟基酮的方法。
2、为此，在本专利技术的一方面，本专利技术提出了一种利用乙酰羟酸合酶制备芳香族α-羟基酮的方法，其包括：
3、(1)制备表达乙酰羟酸合酶的全细胞乙酰羟酸合酶mr-bsalss生物催化剂；
4、(2)以芳香取代醛和丙酮酸作为底物，在全细胞乙酰羟酸合酶mr-bsalss生物催化剂的催化下，获得芳香族α-羟基酮。
5、根据本专利技术实施例的利用乙酰羟酸合酶bsalss制备芳香族α-羟基酮的方法，该方法提供的全细胞乙酰羟酸合酶mr-bsalss生物催化剂可催化16种芳香取代醛与丙酮酸的碳-碳缩合反应合成α-羟基酮。相较于常规使用的合成代谢类乙酰羟酸合酶催化剂，该全细胞乙酰羟酸合酶mr-bsalss生物催化剂介导的反应底物范围广，单次底物负载量高，转化效率高，α-羟基酮产品得率高，减少了催化剂的使用成本。另外，所获得的芳香族α-羟基酮产物分别含有卤素、羟基、甲氧基等修饰，可进一步作为多种药物合成的原料，如拟交感神经药物麻黄生物碱及间羟胺、甲氧胺、法尼基转移酶抑制剂kurasoina及kurasoinb等。
6、另外，根据本专利技术上述实施例提出的利用乙酰羟酸合酶bsalss制备芳香族α-羟基酮的方法，还可以具有如下附加的技术特征：
7、可选地，所述乙酰羟酸合酶bsalss的氨基酸序列如seq id no.1所示。
8、可选地，所述乙酰羟酸合酶bsalss为粗细胞或纯化酶
9、可选地，所述芳香取代醛包括苯甲醛、对羟基苯甲醛、4-甲氧基苯甲醛、4-氟苯甲醛、4-氯苯甲醛、4-溴苯甲醛、2-羟基苯甲醛、2-甲氧基苯甲醛、2-氟苯甲醛、2-氯苯甲醛、2-溴苯甲醛、3-羟基苯甲醛、香兰醛、3,4-二羟基苯甲醛、3,4-二甲氧基苯甲醛、2,5-二甲氧基苯甲醛中的一种。
10、可选地，所述芳香族α-羟基酮为苯乙酰基甲醇、1-羟基-1-(4-羟基苯基)丙-2-酮、1-羟基-1-(4-甲氧基苯基)丙-2-酮、1-(4-氟苯基)-1-羟基丙-2-酮、1-(4-氯苯基)-1-羟基丙-2-酮、1-(4-溴苯基)-1-羟基丙-2-酮、1-羟基-1-(2-羟基苯基)丙-2-酮、1-羟基-1-(2-甲氧基苯基)丙-2-酮、1-(2-氟苯基)-1-羟基丙-2-酮、1-(2-氯苯基)-1-羟基丙-2-酮、1-(2-溴苯基)-1-羟基丙-2-酮、1-羟基-1-(3-羟基苯基)丙-2-酮、1-羟基-1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙-2-酮、1-(3,4-二羟基苯基)-1-羟基丙-2-酮、1-(3,4-二甲氧基苯基)-1-羟基丙-2-酮或1-(2,5-二甲氧基苯基)-1-羟基丙-2-酮。
11、可选地，所述全细胞乙酰羟酸合酶mr-bsalss生物催化剂的制备包括：
12、以枯草芽孢杆菌基因组bacillus subtilis 168为模板，用核苷酸序列如seq idno.3所示alss.bs_fwd和核苷酸序列如seq id no.4所示alss.bs_rev引物组合，通过pcr扩增得到bsalss基因；
13、将所述bsalss基因与表达载体prsfduet-1通过多克隆位点bamhi和xhoi连接，构建重组表达载体prsf-bsalss；
14、将所述重组表达载体prsf-bsalss转入大肠杆菌mg1655 rare(de3)，构建重组工程菌株mr-bsalss；
15、将所述重组工程菌株mr-bsalss诱导表达重组酶，诱导结束收获菌体，离心去上清，磷酸盐缓冲液重悬，离心去上清，磷酸缓冲液定容至终浓度30g/l，获得全细胞乙酰羟酸合酶mr-bsalss生物催化剂。
16、可选地，步骤(2)的反应体系还包括辅因子：硫胺素焦磷酸、葡萄糖、氯化钾、硫酸镁、二硫苏糖醇和磷酸盐缓冲液。
17、进一步地，所述辅因子浓度为：氯化钾浓度60mm，硫酸镁浓度5mm，二硫苏糖醇浓度500μm，硫胺素焦磷酸浓度100μm；磷酸盐缓冲液包含磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，浓度为100mm，ph值为7.0。
18、可选地，步骤(2)的反应条件为：30℃摇床、250rpm反应24小时。
19、可选地，步骤(2)中，所述全细胞乙酰羟酸合酶mr-bsalss生物催化剂的浓度为10g/l。
20、本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。
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1.一种利用乙酰羟酸合酶制备芳香族α-羟基酮的方法，其特征在于，包括：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乙酰羟酸合酶BsAlsS的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乙酰羟酸合酶BsAlsS为粗细胞或纯化酶。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述芳香取代醛包括苯甲醛、对羟基苯甲醛、4-甲氧基苯甲醛、4-氟苯甲醛、4-氯苯甲醛、4-溴苯甲醛、2-羟基苯甲醛、2-甲氧基苯甲醛、2-氟苯甲醛、2-氯苯甲醛、2-溴苯甲醛、3-羟基苯甲醛、香兰醛、3,4-二羟基苯甲醛、3,4-二甲氧基苯甲醛、2,5-二甲氧基苯甲醛中的一种。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述芳香族α-羟基酮为苯乙酰基甲醇、1-羟基-1-(4-羟基苯基)丙-2-酮、1-羟基-1-(4-甲氧基苯基)丙-2-酮、1-(4-氟苯基)-1-羟基丙-2-酮、1-(4-氯苯基)-1-羟基丙-2-酮、1-(4-溴苯基)-1-羟基丙-2-酮、1-羟基-1-(2-羟基苯基)丙-2-酮、1-羟基-1-(2-甲氧基苯基
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述全细胞乙酰羟酸合酶MR-BsAlsS生物催化剂的制备包括：
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)的反应体系还包括辅因子：硫胺素焦磷酸、葡萄糖、氯化钾、硫酸镁、二硫苏糖醇和磷酸盐缓冲液。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述辅因子浓度为：氯化钾浓度60mM，硫酸镁浓度5mM，二硫苏糖醇浓度500μM，硫胺素焦磷酸浓度100μM；磷酸盐缓冲液包含磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，浓度为100mM，pH值为7.0。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)的反应条件为：30℃摇床、250rpm反应24小时。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述全细胞乙酰羟酸合酶MR-BsAlsS生物催化剂的浓度为10g/L。
...【技术特征摘要】
1.一种利用乙酰羟酸合酶制备芳香族α-羟基酮的方法，其特征在于，包括：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乙酰羟酸合酶bsalss的氨基酸序列如seq id no.1所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乙酰羟酸合酶bsalss为粗细胞或纯化酶。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述芳香取代醛包括苯甲醛、对羟基苯甲醛、4-甲氧基苯甲醛、4-氟苯甲醛、4-氯苯甲醛、4-溴苯甲醛、2-羟基苯甲醛、2-甲氧基苯甲醛、2-氟苯甲醛、2-氯苯甲醛、2-溴苯甲醛、3-羟基苯甲醛、香兰醛、3,4-二羟基苯甲醛、3,4-二甲氧基苯甲醛、2,5-二甲氧基苯甲醛中的一种。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述芳香族α-羟基酮为苯乙酰基甲醇、1-羟基-1-(4-羟基苯基)丙-2-酮、1-羟基-1-(4-甲氧基苯基)丙-2-酮、1-(4-氟苯基)-1-羟基丙-2-酮、1-(4-氯苯基)-1-羟基丙-2-酮、1-(4-溴苯基)-1-羟基丙-2-酮、1-羟基-1-(2-羟基苯基)丙-2-酮、1-羟基-1-(2-甲氧基苯基)丙-2-酮、1-(2-氟苯基)-1-羟基丙-2-酮、1-(2-氯苯基)-...
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