【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及固定化酶的制备方法及其在环境修复领域的应用。
技术介绍
1、有机污染土壤是一个需要重点关注的环境问题，传统热脱附、气相抽提、淋洗和氧化还原等物理化学方法，能耗高、劳动强度大、价格昂贵，大量使用化学药剂，存在二次污染。生物修复方法具有相对较低的成本、较少的能量消耗，更加绿色安全，但修复周期较长，且菌剂与土著微生物竞争，在实际场地土壤中很难存活。微生物菌剂催化降解有机污染物往往通过系列氧化还原酶发挥作用，但是游离酶易失活，难以在实际土壤修复中长久发挥作用。酶的固定化是改善酶性能的一种有效方法，它是用物理或化学的方法将酶固定在载体上，以降低土壤复杂环境对酶的影响，提高酶稳定性、适应性和可操作性。与游离酶相比，固定化酶具有更好的催化活性、ph和热稳定性以及可重复使用性，其已被证明特别适用于去除染料(孔雀石绿、茜素绿和甲基橙)、2,4-二氯苯酚、1,3-二氯-2-丙醇、菲、蒽和苯并[a]芘等有机污染。固定化可以为游离酶提供相对稳定的空间，从而提高性能降低成本，如申请号为202211322818.6的中国专利中以海藻酸钠与纤维素的混合溶液制备的凝胶微球来固定化酶。此外，载体材料也可以吸附环境中的污染物，但污染物并没有被彻底去除，仅仅是转移至载体材料上，同时载体材料进入土壤可能会出现二次污染问题。固定化酶用于生态修复的研究仍处于实验室或小规模阶段，如果用于实际土壤生态修复往往存在不可降解载体引起的二次污染、载体制备成本高且无法大规模使用、传质效率低的技术问题，使固定化酶在污染物去除的工程应用中受阻。
1、本专利技术是要解决现有的通过酶固定化修复土壤的方法容易造成二次污染、成本高、传质效率低的技术问题，而提供一种皂素改性膨润土固载酶的制备方法及应用。
2、本专利技术的皂素改性膨润土固载酶的制备方法，按以下步骤进行：
3、一、称取钙基膨润土、皂素和去离子水并加入到容器中，在温度为60℃的条件下磁力搅拌4～5h，离心分离，将固相物依次用质量百分浓度为75％的乙醇溶液、蒸馏水洗涤，再在温度为80～85℃的条件下烘干，研磨过200目筛网，得到皂素改性膨润土；其中皂素的添加量为钙基膨润土阳离子交换容量的20％～40％，去离子水与钙基膨润土的质量比为1：(40～50)；
4、二、将皂素改性膨润土加入到白腐真菌粗酶液中进行酶固定化，再用ph值为5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤干净，冷冻干燥，得到皂素改性膨润土固载酶。
5、更优选的，步骤二中所述的皂素改性膨润土的质量与酶活力为1.2～1.5u/ml的白腐真菌粗酶液的体积之比为1g:(4～5)ml。
6、更优选的，步骤二所述的酶固定化时间为10～12h。
7、上述方法制备的皂素改性膨润土固载酶的应用，是将皂素改性膨润土固载酶用于有机污染的水体或土壤的生态修复中。
8、更优选的，利用皂素改性膨润土固载酶生态修复有机污染水体的方法，按以下步骤进行：将皂素改性膨润土固载酶加入到有机污染的水体中，同时添加反应介体、乙腈和表面活性剂，并用ph 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调节系统ph至弱酸性，混合均匀后得到混合液；再将混合液在温度为30℃的条件下震荡反应1～8h，完成有机污染水体的修复。
9、更优选的，其中皂素改性膨润土固载酶的质量与有机污染水体中污染物的质量之比为1g：(0.7～1.0)mg。
10、更优选的，反应介体为1-羟基苯并三唑(hbt)，混合液中1-羟基苯并三唑的摩尔浓度为1.0～1.2mmol/l。
11、更优选的，混合液中乙腈的体积百分浓度为10％～12％，其中乙腈起促溶作用。
12、更优选的，表面活性剂为tween 80，混合液中tween 80的体积百分浓度为1.0％～1.2％。
13、更优选的，利用皂素改性膨润土固载酶生态修复有机污染土壤的方法，按以下步骤进行：将皂素改性膨润土固载酶加入到有机污染的土壤中，同时添加反应介体和表面活性剂，并补充ph值为5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调节土壤含水率，混合均匀后，降解4～30天，完成有机污染土壤的修复。
14、更优选的，改性膨润土固载酶与有机污染土壤的质量比为(0.09～0.11)：1。
15、更优选的，反应介体为1-羟基苯并三唑(hbt)，每1g有机污染土壤中添加反应介体1～1.5mg。
16、更优选的，表面活性剂为nk-bsoil-3，每1g有机污染土壤中添加nk-bsoil-3的质量为10～15mg。
17、更优选的，每1g有机污染土壤中添加ph值为5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液的量为0.4～0.5ml。
18、本专利技术提供了一种皂素改性膨润土固载酶及其在有机污染土壤生态修复中的应用方法。本专利技术采用皂素改性膨润土作为酶固定化载体，膨润土具有良好的吸水性、保水性和生物相容性，同时将表面活性剂皂素扦插到膨润土中，有利于提高膨润土内部及表面的官能团，从而提高对污染物的吸附性能及对酶的固载性能。膨润土的吸水保湿特性可在土壤界面为酶分子提供适宜的微环境以有效发挥催化降解作用，进而克服游离酶在土壤中完全失活的问题。在膨润土表面和内部扦插入皂素上的官能团，可吸咐白腐真菌胞外酶，同时聚集吸附土壤污染物，使土壤污染物被快速吸附并去除。
19、本专利技术利用皂素改性膨润土制备皂素改性膨润土固载酶，该方法操作简便，成本低廉，绿色友好，重复性好。用于苯并[a]芘污染水体生态修复时，2h后体系中苯并[a]芘的去除率即可达95％以上。用于苯并[a]芘污染土壤生态修复时，15d后苯并[a]芘的去除率达到82.63％，降解30d后，污染物苯并[a]芘的去除率达到91.69％。
20、本专利技术的污染土壤的生态修复方法，操作便利、成本低廉、修复高效、安全无毒、固定化载体膨润土对土壤不会造成二次污染，对有机污染的水体和土壤进行生态修复，可用于环境生态修复领域。
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1.一种皂素改性膨润土固载酶的制备方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
2.根据权利要求1所述的一种皂素改性膨润土固载酶的制备方法，其特征在于，步骤二中所述的皂素改性膨润土的质量与酶活力为1.2～1.5U/mL的白腐真菌粗酶液的体积之比为1g:(4～5)mL。
3.根据权利要求1或2所述的一种皂素改性膨润土固载酶的制备方法，其特征在于，步骤二中所述的酶固定化时间为10～12h。
4.利用权利要求1所述方法制备的皂素改性膨润土固载酶的应用，其特征在于该应用是将皂素改性膨润土固载酶用于有机污染的水体或土壤的生态修复中。
5.根据权利要求4所述的皂素改性膨润土固载酶的应用，其特征在于，利用皂素改性膨润土固载酶生态修复有机污染水体的方法，按以下步骤进行：将皂素改性膨润土固载酶加入到有机污染的水体中，同时添加反应介体、乙腈和表面活性剂，并用pH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调节系统pH至弱酸性，混合均匀后得到混合液；再将混合液在温度为30℃的条件下震荡反应1～8h，完成有机污染水体的修复。
6.根据权利要求5所述的皂素改性膨润土固
7.根据权利要求5或6所述的皂素改性膨润土固载酶的应用，其特征在于，混合液中乙腈的体积百分浓度为10％～12％。
8.根据权利要求5或6所述的皂素改性膨润土固载酶的应用，其特征在于，所述的表面活性剂为Tween 80，混合液中Tween 80的体积百分浓度为1.0％～1.2％。
9.根据权利要求4所述的皂素改性膨润土固载酶的应用，其特征在于，利用皂素改性膨润土固载酶生态修复有机污染土壤的方法，按以下步骤进行：将皂素改性膨润土固载酶加入到有机污染的土壤中，同时添加反应介体和表面活性剂，并用pH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调节土壤含水率，混合均匀后，降解4～30天，完成有机污染土壤的修复。
10.根据权利要求9所述的皂素改性膨润土固载酶的应用，其特征在于改性膨润土固载酶与有机污染土壤的质量比为(0.09～0.11)：1。
...【技术特征摘要】
1.一种皂素改性膨润土固载酶的制备方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
2.根据权利要求1所述的一种皂素改性膨润土固载酶的制备方法，其特征在于，步骤二中所述的皂素改性膨润土的质量与酶活力为1.2～1.5u/ml的白腐真菌粗酶液的体积之比为1g:(4～5)ml。
3.根据权利要求1或2所述的一种皂素改性膨润土固载酶的制备方法，其特征在于，步骤二中所述的酶固定化时间为10～12h。
4.利用权利要求1所述方法制备的皂素改性膨润土固载酶的应用，其特征在于该应用是将皂素改性膨润土固载酶用于有机污染的水体或土壤的生态修复中。
5.根据权利要求4所述的皂素改性膨润土固载酶的应用，其特征在于，利用皂素改性膨润土固载酶生态修复有机污染水体的方法，按以下步骤进行：将皂素改性膨润土固载酶加入到有机污染的水体中，同时添加反应介体、乙腈和表面活性剂，并用ph 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调节系统ph至弱酸性，混合均匀后得到混合液；再将混合液在温度为30℃的条件下震荡反应1～8h，完成有机污染水体的修复。
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