【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞免疫治疗领域，更具体地，涉及一种靶向cd5的膜表面工程化nk细胞的制备方法及药物组合物及应用。
技术介绍
1、急性淋巴细胞白血病是儿童肿瘤中最为常见的恶性肿瘤之一，急性t淋巴细胞白血病(t cell acute lymphocyte leukemia,t-all)在其中约占10-15％。相较于b型急性淋巴细胞白血病(b cell acute lymphocyte leukemia,b-all)儿童t-all的治疗效果较差，复发难治t-all患者无事件生存率和总生存率低于25％。
2、抗原嵌合受体t细胞(chimeric antigen receptor t cell,car-t)在b型血液恶性肿瘤中取得了令人瞩目的疗效，但car-t在治疗复发难治t-all上存在t细胞功能异常、肿瘤污染、靶点重叠等问题，因此使用受到明显的限制。
3、自然杀伤细胞(natural killer cell,nk)可以非特异性识别和杀伤肿瘤细胞，且在抗肿瘤的同时没有明显gvhd反应，最重要的是nk细胞与t细胞在许多膜表面蛋白存在差异，这使得nk相关的细胞免疫治疗或能成为治疗复发难治急性t淋巴细胞白血病的突破点。目前，已有研究者尝试使用慢病毒制备靶向cd5、cd7的car-nk细胞。然而，car-nk在治疗急性t淋巴细胞白血病的实际的应用中并未获得期待的疗效。首先，nk细胞慢病毒转导效率较低，病毒感染后扩增能力下降，导致制备car-nk困难；其次，缺乏il-15等细胞因子的car-nk细胞在体内扩增不佳，无法达到
4、另外，目前应用点击化学和生物正交反应制备细胞免疫药物正成为新的研究热点。生物正交反应是可以在活细胞、活体动物等环境下与某一分子快速发生化学反应的过程，该过程不对周围的生物体系产生影响，具有反应迅速、反应环境简单等特点。当前，生物正交反应在活细胞成像、药物可控靶向释放、抗体药物偶联上运用广泛。叠氮和炔烃(dbco、tco、bcn、四嗪等)是可以发生生物正交反应的常见物质，叠氮在生物体系中非常少见，这保证了反应的特异性。
技术实现思路
1、本专利技术旨在克服上述现有技术的至少一种缺陷(不足)，提供一种靶向cd5的膜表面工程化nk细胞的制备方法及药物组合物及应用，通过糖代谢工程以及生物正交反应制备藕联dbco-cd5抗体和dbco-il-15细胞因子的nk细胞，赋予nk细胞靶向杀伤t-all肿瘤的能力，同时靶向递送il-15细胞因子，二者协同增强nk细胞杀伤t-all肿瘤的疗效，为治疗复发难治t-all提供一条新思路。
2、本专利技术的一个目的是提供一种靶向cd5的膜表面工程化nk细胞的制备方法，包括以下步骤：s1、所述nk细胞为从血液中提取单个核细胞，体外激活；s2、采用步骤s1获得的nk细胞与ac4mannaz溶液共培养24-72小时，获得nk-ac4mannaz；s3、制备dbco-peg4-nh2修饰的anti-cd5抗体，通过两步法酶促dbco-peg4-nh2修饰抗体fc段；s4、制备dbco-peg4-nhs修饰的il-15细胞因子；s5、通过点击化学将步骤s3得到的anti-cd5抗体和步骤s4得到的il-15细胞因子共价偶联于步骤s2得到的nk-ac4mannaz，获得nk-cd5-il-15细胞。
3、相比于car-nk或car-t细胞的制备，本专利技术通过共价键藕连抗体而非病毒载体制备具有靶向性的nk细胞，消除了采用病毒载体转导随机插入遗传序列所引发的潜在危险；其次，car-t在治疗复发难治t-all上存在t细胞功能异常、肿瘤污染、靶点重叠等问题，本专利技术方法所制备的nk细胞也能避免上述问题；再次，将il-15细胞因子藕联与nk细胞，通过靶向递送有效的增强nk细胞抗肿瘤的疗效以及体内扩增能力，同时减少了大剂量细胞因子对于正常组织器官带来的损害。可以理解为，nk-cd5-il-15细胞在赋予nk细胞靶向杀伤t-all肿瘤的同时，靶向递送il-15细胞因子，二者协同增强nk细胞杀伤t-all以及其他cd5+肿瘤的疗效，具有极大的临床应用前景。
4、进一步地，所述步骤s1具体为：采集健康人外周血液，提取单个核细胞用anti-cd16抗体、il-2、il-15、il-18、il-21细胞因子在体外激活12～15天，获得高纯度的nk细胞。
5、进一步地，所述步骤s2具体为：采用步骤s1获得的nk细胞，配制细胞浓度为1×107-5×107/ml的nk细胞悬液；加入浓度为10-100μm的ac4mannaz溶液，共培养24-72小时，获得nk-ac4mannaz。
6、进一步地，所述步骤s3具体为：取pbs溶解anti-cd5抗体稀释至浓度0.8～1.5mg/ml,加入肽-n-糖苷酶f 6～10unites，37℃下孵育过夜，在所述浓度及温度条件下能最大程度的去除抗体fc段的糖苷，从而暴露与dbco-peg4-nh2的结合位点，超滤离心后，超滤后的液体再次溶解于0.8～1.5ml pbs，后再加入谷氨酰胺酶转氨酶6～10unites和8～15μl浓度为80～120mm的dbco-peg4-nh2，上述条件下能够保证每一个抗体偶联2个dbco-peg4-nh2，37℃孵育过夜，超滤离心2次后，获得纯化的dbco-cd5抗体。
7、dbco-cd5抗体即dbco-peg4-nh2修饰的anti-cd5抗体。anti-cd5抗体与n-糖酰胺酶f(pngase f)酶的作用下，抗体的fc段asn297位点的n-乙酰葡萄糖胺和天冬酰氨残基之间的酰胺键被切割，在谷氨酰胺转氨酶(mtg)的作用下去除糖苷的抗体与dbco-peg4-nh2在抗体fc段共价结合，可以dbco-peg4-nh2定点修饰的anti-cd5抗体。
8、进一步地，所述步骤s4具体为：将dbco-peg4-nhs溶解于二甲亚砜中，终浓度为80～120mm，pbs溶解il-15细胞因子至0.8～1.2μg/ml，取8～10μl溶解后的dbco-peg4-nhs与il-15细胞因子，加入0.8～1.2ml pbs中继续溶解，低温放置23～28小时，得到dbco-il-15混合溶液，超滤离心去除多余dbco-peg4-nhs，获得dbco-il-15。
9、所述dbco-il-15即dbco-peg4-nhs修饰的il-15细胞因子，所述低温优选为4～6℃。
10、进一步地，所述步骤s5具体为：采用步骤s3中获得的dbco-cd5抗体配置成浓度为0.1-1mg/ml的anti-cd5抗体溶液；采用步骤s4中获得的dbco-il-15配置成浓度为20-200ng/ml的il-15细胞因子溶液；将所述anti-cd5抗本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种靶向CD5的膜表面工程化NK细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的靶向CD5的膜表面工程化NK细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤S1具体为：采集健康人外周血液，提取单个核细胞用Anti-CD16抗体、IL-2、IL-15、IL-18、IL-21细胞因子在体外激活12～15天此处，获得高纯度的NK细胞。
3.根据权利要求1所述的靶向CD5的膜表面工程化NK细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤S2具体为：采用步骤S1获得的NK细胞，配制细胞浓度为1×107-5×107/mL的NK细胞悬液；加入浓度为10-100μM的Ac4ManNAz溶液，共培养24-72小时，获得NK-Ac4ManNAz。
4.根据权利要求1所述的靶向CD5的膜表面工程化NK细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤S3具体为：取PBS溶解Anti-CD5抗体稀释至浓度0.8～1.5mg/mL，加入肽-N-糖苷酶F6～10Unites，37℃过夜，超滤离心后，超滤后的液体再次溶解于0.8～1.5mL PBS，后再加入谷氨酰胺酶转氨酶6～10Uni
5.根据权利要求1所述的靶向CD5的膜表面工程化NK细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤S4具体为：将DBCO-PEG4-NHS溶解于二甲亚砜中，终浓度为80～120mM，PBS溶解IL-15细胞因子至0.8～1.2μg/mL，取8～10μl溶解后的DBCO-PEG4-NHS与IL-15细胞因子，加入0.8～1.2mL PBS中继续溶解，低温放置23～28小时，得到DBCO-IL-15混合溶液，超滤离心去除多余DBCO-PEG4-NHS，获得DBCO-IL-15。
6.根据权利要求5所述的靶向CD5的膜表面工程化NK细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤S5具体为：采用步骤S3中获得的DBCO-CD5抗体配置成浓度为0.1-1mg/mL的Anti-CD5抗体溶液；采用步骤S4中获得的DBCO-IL-15配置成浓度为20-200ng/mL的IL-15细胞因子溶液；将所述Anti-CD5抗体溶液、IL-15细胞因子溶液和步骤S2中获得的NK-Ac4ManNAz低温共孵育0.5-2h，获得NK-CD5-IL-15细胞。
7.根据权利要求3所述的靶向CD5的膜表面工程化NK细胞的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，Ac4ManNAz溶液的浓度为50μM，培养时间为48小时。
8.根据权利要求6所述的靶向CD5的膜表面工程化NK细胞的制备方法，其特征在于，在步骤S5中，采用步骤S3中获得的DBCO-CD5抗体配置成浓度为0.1-0.5mg/mL的Anti-CD5抗体溶液；采用步骤S4中获得的DBCO-IL-15配置成浓度为20-50ng/mL的IL-15细胞因子溶液，孵育时间为1h。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1～8任一所述制备方法制备的膜表面工程化NK细胞以及任选的药学上可接受的辅料。
10.一种如权利要求1～8中任一项所述的制备方法所制备的膜表面工程化NK细胞的应用，其特征在于，用于治疗或辅助治疗CD5+肿瘤。
...【技术特征摘要】
1.一种靶向cd5的膜表面工程化nk细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的靶向cd5的膜表面工程化nk细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤s1具体为：采集健康人外周血液，提取单个核细胞用anti-cd16抗体、il-2、il-15、il-18、il-21细胞因子在体外激活12～15天此处，获得高纯度的nk细胞。
3.根据权利要求1所述的靶向cd5的膜表面工程化nk细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤s2具体为：采用步骤s1获得的nk细胞，配制细胞浓度为1×107-5×107/ml的nk细胞悬液；加入浓度为10-100μm的ac4mannaz溶液，共培养24-72小时，获得nk-ac4mannaz。
4.根据权利要求1所述的靶向cd5的膜表面工程化nk细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤s3具体为：取pbs溶解anti-cd5抗体稀释至浓度0.8～1.5mg/ml，加入肽-n-糖苷酶f6～10unites，37℃过夜，超滤离心后，超滤后的液体再次溶解于0.8～1.5ml pbs，后再加入谷氨酰胺酶转氨酶6～10unites和8～15μl浓度为80～120mm的dbco-peg4-nh2，37℃过夜后，超滤离心去除多余物质，获得dbco-cd5抗体。
5.根据权利要求1所述的靶向cd5的膜表面工程化nk细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤s4具体为：将dbco-peg4-nhs溶解于二甲亚砜中，终浓度为80～120mm，pbs溶解il-15细胞因子至0.8～1.2μg/ml，取8～10μl溶解后的dbco-peg4-nhs与il-15细...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄松音，刘典典，姚燕丹，苏鸿君，杨洁文，
申请(专利权)人：中山大学孙逸仙纪念医院，
类型：发明
国别省市：
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