【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用枯草芽孢杆菌高效表达蔗糖酶的方法，属于基因工程以及微生物工程。
技术介绍
1、蔗糖酶(invertase，ec3,2,1,26)又称β-d-呋喃果糖苷水解酶，特异地催化非还原糖中的β-d-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。
2、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)是一种能够高效分泌蛋白的菌株，被广泛应用于工业酶制剂的生产中，具有如下优势：(1)非致病性，不会产生内毒素等物质；(2)蛋白质分泌功能强；(3)没有明显的密码子偏好性，产物不易形成包涵体；(4)培养简单快速。枯草芽孢杆菌wb600(bacillus subtilis wb600)利用基因突变的方法失活枯草168菌株基因组中的六种蛋白酶后，其蛋白酶活性为野生型菌株的0.32％，更有利于表达外源蛋白。然而，不同蛋白在枯草芽孢杆菌中的重组表达水平差异明显。
3、枯草芽孢杆菌中存在四种经典的蛋白分泌途径。为提高目的蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达水平，目前优化蛋白分泌表达的策略主要集中于分泌途径中的某个特定环节。例如增强启动子的转录活性、筛选最适的信号肽、过表达分子伴侣等。然而目的蛋白在枯草芽孢杆菌中进行胞外分泌时需要分泌途径中的各个环节协同发挥作用时才能获得最高胞外表达量。其中，信号肽是辅助前体蛋白折叠以及引导前体蛋白跨膜易位的重要元件，是影响异源蛋白分泌效率以及产量的限制性因素。
4、一种来源于解单端孢菌素微杆菌(microbacter
技术实现思路
1、为解决invdz13蔗糖酶同源表达水平低的问题，本专利技术通过以pbhss4为载体骨架，以枯草芽孢杆菌wb600(bacillus subtilis wb600)为表达宿主，成功表达了解单端孢菌素微杆菌(microbacterium trichothecenolyticum)来源的蔗糖酶invdz13。并通过筛选得到最佳信号肽spyoml、共表达伴侣蛋白复合物grpe-dnak-dnaj以及共表达分泌途径元件sppa，进一步提高了蔗糖酶的表达水平。利用本专利技术中的枯草芽孢杆菌重组菌可高效表达蔗糖酶，以其为生产菌株，摇瓶发酵上清中蔗糖酶的酶活最高达到61.14u/ml。
2、本专利技术提供了一种重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌进行了信号肽筛选，共表达了分子伴侣以及共表达了分泌途径元件。
3、在本专利技术的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌表达了解单端孢菌素微杆菌(microbacterium trichothecenolyticum)来源的蔗糖酶，并进行如下(a)～(c)中的一种或多种改造：
4、(a)采用spyoml信号肽、spyncm信号肽或spyddt信号肽表达所述蔗糖酶；
5、(b)共表达了分子伴侣蛋白prsa、groesl、dnak中的一种或多种；或表达了伴侣蛋白复合物grpe-dnak-dnaj；
6、(c)共表达了分泌途径蛋白seca、sips、sipt、sppa或tepa。
7、在本专利技术的一种实施方式中，所述spyoml信号肽、spyncm信号肽、spyddt信号肽的核苷酸序列分别如seq id no.2～4所示。
8、在本专利技术的一种实施方式中，所述分子伴侣蛋白prsa、groesl、dnak的gene id分别为：939294(prsa)、938006(groes)、938045(groel)、qkj78448.1(dnak)。
9、在本专利技术的一种实施方式中，所述grpe-dnak-dnaj核苷酸序列如seq id no.5所示。
10、在本专利技术的一种实施方式中，所述分泌途径蛋白seca、sips、sipt、tepa的gene id分别为：936711(seca)、938944(sips)、938763(sipt)、936370(tepa)，编码所述分泌途径蛋白sppa的核苷酸序列如seq id no.6所示。
11、在本专利技术的一种实施方式中，编码所述蔗糖酶invdz13的核苷酸序列如seq idno.1所示。
12、在本专利技术的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌wb600为表达宿主。
13、在本专利技术的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌表达了蔗糖酶，并具有以下(a)～(c)至少两种改进：
14、(a)用信号肽spyoml促进目的蛋白的分泌；
15、(b)通过共表达伴侣蛋白复合物grpe-dnak-dnaj提高目的蛋白的表达水平；
16、(c)通过共表达分泌途径元件sppa提高目的蛋白的表达水平。
17、在本专利技术的一种实施方式中，所述信号肽基因插入在目的基因的上游。
18、本专利技术还提供了一种提高枯草芽孢杆菌表达蔗糖酶的表达量的方法，所述重组枯草芽孢杆菌表达了解单端孢菌素微杆菌(microbacterium trichothecenolyticum)来源的蔗糖酶，并进行如下(a)～(c)中的一种或多种改造：
19、(a)采用spyoml信号肽、spyncm信号肽或spyddt信号肽表达所述蔗糖酶；
20、(b)共表达了分子伴侣蛋白prsa、groesl、dnak中的一种或多种；或表达了伴侣蛋白复合物grpe-dnak-dnaj；
21、(c)共表达了分泌途径蛋白seca、sips、sipt、sppa或tepa。
22、在本专利技术的一种实施方式中，所述spyoml信号肽、spyncm信号肽、spyddt信号肽的核苷酸序列分别如seq id no.2～4所示。
23、在本专利技术的一种实施方式中，所述分子伴侣蛋白prsa、groesl、dnak的gene id分别为：939294(prsa)、938006(groes)、938045(groel)、qkj78448.1(dnak)。
24、在本专利技术的一种实施方式中，所述grpe-dnak-dnaj核苷酸序列如seq id no.5所示。
25、在本专利技术的一种实施方式中，所述分泌途径蛋白seca、sips、sipt、tepa的gene id分别为：936711(seca)、938944(sips)、938763(sipt)、936370(tepa)，编码所述分泌途径蛋白sppa的核苷酸序列如seq id no.6所示。
26、在本专利技术的一种实施方式中，编码本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌表达了解单端孢菌素微杆菌(Microbacterium trichothecenolyticum)来源的蔗糖酶，并进行如下(a)～(c)中的一种或多种改造：
2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述SPYomL信号肽、SPYncM信号肽、SPYddT信号肽的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2～4所示；所述分子伴侣蛋白PrsA、GroESL、DnaK的GENE ID分别为：939294(prsA)、938006(groES)、938045(groEL)、QKJ78448.1(DnaK)；所述grpE-dnaK-dnaJ核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述分泌途径蛋白secA、sipS、sipT、tepA的GENE ID分别为：936711(secA)、938944(sipS)、938763(sipT)、936370(tepA)；编码所述分泌途径蛋白sppA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.根据权利要求1或2所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，编码所述蔗糖酶I
4.根据权利要求1～3任一所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌WB600为表达宿主。
5.一种提高枯草芽孢杆菌表达蔗糖酶的表达量的方法，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌表达了解单端孢菌素微杆菌来源的蔗糖酶，并进行如下(a)～(c)中的一种或多种改造：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述SPYomL信号肽、SPYncM信号肽、SPYddT信号肽的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2～4所示；所述分子伴侣蛋白PrsA、GroESL、DnaK的GENEID分别为：939294(prsA)、938006(groES)、938045(groEL)、QKJ78448.1(DnaK)；所述grpE-dnaK-dnaJ核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述分泌途径蛋白secA、sipS、sipT、tepA的GENE ID分别为：936711(secA)、938944(sipS)、938763(sipT)、936370(tepA)；编码所述分泌途径蛋白sppA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，编码所述蔗糖酶InvDz13的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；优选的，所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌WB600为表达宿主。
8.一种蔗糖酶的制备方法，其特征在于，所述方法为，采用权利要求1～4任一所述的重组枯草芽孢杆菌发酵制备得到的。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法为，将所述重组枯草芽孢杆菌先接种于种子培养基中，于35～38℃、180～220rpm下培养8～12h，得到种子液；将种子液按1％～3％的接种量，接种至发酵培养基中，于30～37℃、180～220rpm下培养45～50h，得到含有蔗糖酶的发酵液。
10.权利要求1～4任一所述的重组枯草芽孢杆菌在制备蔗糖酶或含有蔗糖酶的食品、洗涤用品、造纸用品、纺织用品、酒精用品和医药品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌表达了解单端孢菌素微杆菌(microbacterium trichothecenolyticum)来源的蔗糖酶，并进行如下(a)～(c)中的一种或多种改造：
2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述spyoml信号肽、spyncm信号肽、spyddt信号肽的核苷酸序列分别如seq id no.2～4所示；所述分子伴侣蛋白prsa、groesl、dnak的gene id分别为：939294(prsa)、938006(groes)、938045(groel)、qkj78448.1(dnak)；所述grpe-dnak-dnaj核苷酸序列如seq id no.5所示；所述分泌途径蛋白seca、sips、sipt、tepa的gene id分别为：936711(seca)、938944(sips)、938763(sipt)、936370(tepa)；编码所述分泌途径蛋白sppa的核苷酸序列如seq id no.6所示。
3.根据权利要求1或2所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，编码所述蔗糖酶invdz13的核苷酸序列如seq id no.1所示。
4.根据权利要求1～3任一所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌wb600为表达宿主。
5.一种提高枯草芽孢杆菌表达蔗糖酶的表达量的方法，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌表达了解单端孢菌素微杆菌来源的蔗糖酶，并进行如下(a)～(c)中的一种或多种改造：
6.根据权利要求5所述的方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚动邦，陈媛媛，肖亚中，房伟，方泽民，刘娟娟，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：
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