【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及复杂基质中透明质酸检测，特别是涉及一种织物中透明质酸含量的检测方法。
技术介绍
1、透明质酸(即玻尿酸，ha)是一种由d-葡糖醛酸和n-乙酰氨基葡糖双糖单位交替连接而成的直链高分子糖胺聚糖，分子量可达5～20000kda，是脊椎动物软骨、滑液、牙龈、皮肤和眼睛玻璃体液中的重要结构性物质，透明质酸在体内维持这这些部位的细胞外空间，具有保水和润滑作用，能够调节细胞渗透压，促进细胞修复。
2、透明质酸是一种在临床上具有高价值的生化药物，可以作为人体结构物质用于各类手术中，例如在眼科手术中用于治疗青光眼、晶体植入和角膜移植等，也可作为关节炎治疗药物，还可以将其作为保湿剂用于化妆品中。
3、透明质酸具有优异的保水性能，透明质酸结构中的羟基和其他极性分子基团以及h2o因形成氢键而结合在一起，可以结合自身400倍以上的水分，高浓度的透明质酸可以交联成膜状结构并具有一定黏弹性，皮肤的老化与胶原蛋白的流失有关，而胶原蛋白的流失则由透明质酸含量降低引起，因此化妆品中常将透明质酸作为皮肤的补水剂。
4、常见的透明质酸检测范围包括生成透明质酸的发酵液原液、存在透明质酸的人体生物样本(如血液)、化妆品或药品原料以及含有透明质酸的织物等成品。这些样品来源多种多样，成分复杂，且透明质酸作为一种多糖聚合物，分子量各异，尤其是织物中的透明质酸能与织物纤维结合在一起，难以进行洗脱，这些因素对透明质酸的定量增加了难度。
5、目前，透明质酸常见的检测方法有：hplc法、比色法、咔唑显色法和ctab比浊法。这
6、hplc法是利用特定色谱柱条件来检测经过样品前处理的透明质酸，常见方法有对透明质酸进行酸水解或特定生物酶解和柱前衍生化等步骤，使透明质酸分解为具有紫外吸收的小分子物质后用色谱峰面积进行定量，或采用凝胶色谱柱的方法对透明质酸进行梯度洗脱定量。用hplc检测透明质酸的检测条件较为苛刻，需要使用色谱柱，成本高，对操作人员要求高，且只适用于成分较单一的样品检测。
7、比色法检测透明质酸是基于氨基糖类的检测方法，透明质酸是由d-葡萄糖醛酸和n-乙酰葡萄糖胺两种最小结构单元组成的双糖单位糖胺聚糖，在碱性条件下，氨基糖类形成发色团，与欧立希试剂(ehrlich’s reagent)，即酸性对二甲基氨基苯甲醛(n,n-dimethyl p-aminobenzaldehyde)反应，产生紫红色复合物，可在530nm波长下检测吸光度值从而对透明质酸进行定量，难以排除其他氨基糖类等杂质的干扰，且使用有毒试剂使得实验操作危险性大。
8、咔唑显色法是将硼砂作为催化剂，用浓硫酸将透明质酸分解为葡萄糖醛酸单体，而后采用咔唑与葡萄糖醛酸形成紫色络合物，根据该络合物的吸光度值与葡萄糖醛酸浓度称正比间接计算透明质酸含量，该方法具有显色迅速、稳定、重复性好等优点，但样品前处理复杂，不利于即时检测，且复杂基质中的杂质可能对该络合反应存在一定干扰。
9、ctab浊度法是采用十六烷基三甲基溴化铵(ctab)等阳离子表面活性剂与透明质酸产生络合反应，络合物使得溶液浑浊并在一定浓度范围内遵循朗伯-比尔定律，因此可以用紫外分光光度计对透明质酸的含量进行定量测定。该方法受样品中杂质的影响较小，但受反应的缓冲溶液影响较大，体系的ph值对定量测定的结果影响较大。
10、目前，透明质酸定量检测过程中存在的主要问题有：
11、(1)透明质酸为多糖，分子量大，一些检测方法如hplc法和咔唑法需要进行复杂的前处理过程，增加了操作难度和成本，降低了方法的实用性；
12、(2)复杂基质中的杂质对检测方法的特异性要求较高，比浊法和比色法等方法的检测结果无法很好排除相似结构的杂质干扰；
13、(3)一些样本如织物上的透明质酸难以洗脱，因此洗脱液中的透明质酸含量较少，该检测要求方法的检测限低，对无法洗脱的透明质酸不能用常规方法进行准确定量，导致检测结果有较大的误差。
14、如：cn106501503a公开了一种透明质酸(ha)测试试剂盒及其制备方法，包括：磁分离试剂，标记habp蛋白的纳米磁性微球，浓度为167μg/ml；试剂r1，含有碱性磷酸酶标记的aggrecan蛋白，所述碱性磷酸酶标记的aggrecan蛋白浓度为1μg/ml；试剂r2，含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液；含有ha抗原的牛血清白蛋白组分五(bsav)溶液的标准品、质控品和校准品；清洗浓缩液，含有tween-20和proclin-300的缓冲液；稀释液，含有牛血清白蛋白组分五(bsav)的溶液；发光底物，金刚烷的衍生物iumiphos530，所述金刚烷的衍生物iumiphos530的浓度为10μg/ml。
15、cn112595845a公开了一种透明质酸检测试剂盒及检测系统，该透明质酸检测试剂盒包括第一试剂、第二试剂、第三试剂及第四试剂，第一试剂中包括第一标记物标记的透明质酸结合物，透明质酸结合物包括明胶和透明质酸，透明质酸结合物中的明胶的平均分子量为50kd～100kd，第二试剂包括透明质酸结合蛋白，第三试剂包括第二标记物标记的透明质酸结合蛋白的抗体，第四试剂包括第三标记物标记的磁性微粒。
16、以上文献中采用的检测方法主要适用于体外诊断(如血清、血液等)的透明质酸定量检测，无法适用于织物上透明质酸的定量检测。因为织物作为固体纤维材料与其他的基质样本(如血液等)有较大差别：(1)透明质酸作为长链高分子化合物在织物上难以用水溶液超声完全洗脱，在织物上的残留无法被确定，也就不能用常规方法或以上文献中的试剂盒直接对水溶液中的透明质酸准确定量检测；(2)织物纤维容易引起非特异性吸附，常规方法或以上文献中的试剂盒中的抗体直接与织物上的透明质酸偶联再定量会引起较大误差。
17、因此，基于现有对透明质酸进行定量方法的优缺点，本领域亟需开发一种用于复杂基质中，尤其是织物中透明质酸含量的定量检测方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种织物中透明质酸含量的定量检测方法。
2、为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案具体如下：
3、一种织物中透明质酸含量的定量检测方法，包括如下步骤：
4、(1)前处理
5、将透明质酸织物样品剪碎后加水溶液进行超声，得到工作溶液1；工作溶液1包括从织物样品上洗脱下来的透明质酸溶液1和未被完全洗脱的透明质酸织物样品2；
6、(2)包被
7、将工作试剂1用酶联免疫法专用碳酸钠缓冲液(cbs)稀释后加入96孔板，加膜孵育过夜，板底包被稀释后的工作试剂1。过夜后去除孔板中的工作试剂1，用洗涤液洗涤3遍后加入封闭液封闭1小时；
8、所述工作试剂1为cd44蛋白捕获抗体；所述封闭液为含有2％ bsa和0.05％tween20的20mm tris，150mm nacl，ph 7.4的缓冲溶液；所述洗涤液为含有0.05％ 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种织物中透明质酸含量的定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的织物中透明质酸含量的定量检测方法，其特征在于：所述工作试剂1是浓度为0.2mg/mL的CD44蛋白捕获抗体溶液，所述碳酸钠缓冲液(CBS)为0.05MNa2CO3，0.05M NaHCO3，pH 9.6，0.2μm滤膜过滤的缓冲液；所述工作试剂1需用CBS缓冲液稀释100倍。
3.根据权利要求1所述的织物中透明质酸含量的定量检测方法，其特征在于：所述工作试剂2是设置一系列浓度梯度的CD44蛋白标准溶液，其浓度范围为0ng/mL～50ng/mL；配制CD44蛋白标准溶液时，CD44蛋白母液稀释需用含有0.1％BSA和0.05％Tween20的20mMTris，150mM NaCl，pH 7.4的缓冲溶液。
4.根据权利要求1所述的织物中透明质酸含量的定量检测方法，其特征在于：所述工作试剂3是浓度为0.25μg/mL的带有辣根过氧化物酶标记的抗CD44抗体，所述工作试剂3为0.25mg/mL的高浓度母液由含有0.5％BSA和0.05％Tween20的20m
5.根据权利要求1所述的织物中透明质酸含量的定量检测方法，其特征在于：所述工作溶液4置于酶标仪中，检测450nm处溶液的吸光度值。
6.根据权利要求5所述的织物中透明质酸含量的定量检测方法，其特征在于：将工作溶液4的吸光度值和含有不同浓度透明质酸的织物标准品作出对应的标准曲线，以此计算得到织物中透明质酸的浓度。
7.根据权利要求6所述的织物中透明质酸含量的定量检测方法，其特征在于：将吸光度值A带入吸光度值与含有不同透明质酸浓度的织物之间的关系得到的拟合方程Cx＝0.4322C0-3.3117Ax+0.0176，
8.根据权利要求7中所述的植物中透明质酸含量的定量检测方法，其特征在于：所述CD44蛋白与透明质酸的物质的量浓度化学计量比为55～66mol/L：1mol/L。
...【技术特征摘要】
1.一种织物中透明质酸含量的定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的织物中透明质酸含量的定量检测方法，其特征在于：所述工作试剂1是浓度为0.2mg/ml的cd44蛋白捕获抗体溶液，所述碳酸钠缓冲液(cbs)为0.05mna2co3，0.05m nahco3，ph 9.6，0.2μm滤膜过滤的缓冲液；所述工作试剂1需用cbs缓冲液稀释100倍。
3.根据权利要求1所述的织物中透明质酸含量的定量检测方法，其特征在于：所述工作试剂2是设置一系列浓度梯度的cd44蛋白标准溶液，其浓度范围为0ng/ml～50ng/ml；配制cd44蛋白标准溶液时，cd44蛋白母液稀释需用含有0.1％bsa和0.05％tween20的20mmtris，150mm nacl，ph 7.4的缓冲溶液。
4.根据权利要求1所述的织物中透明质酸含量的定量检测方法，其特征在于：所述工作试剂3是浓度为0.25μg/ml的带有辣根过氧化物酶标记的抗cd44抗体，所述工...
【专利技术属性】
技术研发人员：张炜飞，徐丹凤，李红梅，
申请(专利权)人：中国计量科学研究院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。