【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种枯草芽孢杆菌自诱导高效蛋白表达系统的构建及应用，属于基因工程以及微生物工程。
技术介绍
1、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)是一种革兰氏阳性菌模式菌，菌体表面生有鞭毛，体内形成的内生孢子可抵抗恶劣的外在环境而存活。枯草芽孢杆菌因具有强分泌能力、不易形成包涵体、无密码子偏好性、具有清晰的生理和遗传背景，并且非致病性等优点。基于上述优点，已被开发生一种重要的工业酶蛋白原核表达系统。
2、枯草芽孢杆菌表达系统主要分为组成型表达系统和诱导型表达系统。与组成型表达相比，因诱导型表达可有效缓解蛋白表达与菌体生长间的矛盾从而更有利于目的蛋白的高表达。诱导型表达系统又分为诱导剂依赖型表达系统和自诱导型表达系统，其中诱导剂依赖型表达系统需要在诱导剂诱导的情况下表达目的蛋白，然而因诱导剂的使用会造成生产成本的提高且不利于后面目的产品的分离提取。相反，自诱导表达系统不需要添加大量的诱导剂就能达到生产所需，并且能够在没有人类监督的情况下进行自我监测。
3、自诱导型表达系统主要是依赖群体感应系统(quorum sensing，qs)建立的。qs是细菌间存在的一种信息交流现象，在此过程中，细菌可合成并释放信号分子，当胞外信号分子达到一个临界浓度时可以启动菌体中相关基因的表达从而调控细菌的生物行为，如产生荧光等，以适应环境的变化。
4、目前，枯草芽孢杆菌自诱导系统的群体感应机制分为两种，一种是基于枯草芽孢杆菌内源psrfa启动子的群体感应系统，另一种是基于费氏弧菌(vibrio fisc
5、近年来，研究者将luxi/r系统拆分为包括luxi-luxr的诱导模块和由pluxi介导目的基因表达的响应模块两个部分，从而在枯草芽孢杆菌中构建自诱导表达系统。然而，费氏弧菌的luxi/r系统在枯草芽孢杆菌中的应用主要侧重于生产高附加值化学品中，关于生产酶蛋白的研究很少，而且尚未见到利用该系统在枯草芽孢杆菌中自诱导胞外表达酶蛋白的报道。究其原因就是由于费氏弧菌的luxi/r系统在枯草芽孢杆菌中的自诱导表达强度低，从而限制了其在枯草芽孢杆菌自诱导蛋白表达系统开发中的应用。
6、前期研究中，主要通过改造费氏弧菌的luxi/r系统响应模块来提高其在枯草芽孢杆菌中的自诱导表达强度，但效果普遍较差。相反，通过改造费氏弧菌的luxi/r系统诱导模块来提高其在枯草芽孢杆菌中的自诱导表达强度的研究目前尚未报道。
技术实现思路
1、针对上述存在的问题，本专利技术提供了一种枯草芽孢杆菌自诱导高效蛋白表达系统的构建及应用。本专利技术是基于费氏弧菌(vibrio fischeri)的luxi/r群体感应系统，以pbh-amyz1为载体骨架，以枯草芽孢杆菌wb600为表达宿主，实现了海洋庞氏芽孢杆菌(pontibacillus sp.zy)来源的生淀粉α-淀粉酶(amyz1)在枯草芽孢杆菌wb600中的自诱导重组胞外表达，并通过改造诱导模块中的启动子pluxi的-35区和-10区，使枯草芽孢杆菌胞外amyz1活性提高1.83倍。另外，以蔗糖酶invdz13和果聚糖酶39为新模式酶进一步验证了自诱导表达效果。
2、本专利技术提供了一种枯草芽孢杆菌自诱导高效蛋白表达系统，所述的自诱导体系是基于费氏弧菌(vibrio fischeri)来源的luxi/r群体感应系统。
3、在本专利技术的一种实施方式中，自诱导体系分别由自诱导启动子pr61介导的响应模块和包含luxr-luxi表达框的诱导模块组成。
4、在本专利技术的一种实施方式中，所述的响应模块中诱导启动子pr61的核苷酸序列为seq id no.1。
5、在本专利技术的一种实施方式中，所述的诱导模块中luxr的核苷酸序列为seq idno.2。
6、在本专利技术的一种实施方式中，所述的诱导模块中luxi的核苷酸序列为seq idno.3。
7、在本专利技术的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌自诱导表达体系是以载体pbh-amyz1为载体骨架进行构建。
8、在本专利技术的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌wb600为宿主菌进行构建。
9、在本专利技术的一种实施方式中，所述诱导模块包括了启动子pluxi。
10、本专利技术提供了一种自诱导表达载体，所述表达载体上连接有诱导模块和响应模块；所述诱导模块为含有核苷酸序列如seq id no.8所示的启动子pluxr-luxi、核苷酸序列为seq id no.2所示的luxr基因、核苷酸序列为seq id no.3所示的luxi基因的luxr-luxi表达框，所述响应模块中含有核苷酸序列如seq id no.1所示的pr61启动子和目的蛋白。
11、在本专利技术的一种实施方式中，将所述启动子pluxr-luxi中序列中的第187-192位的碱基ttata替换为tacaat、tacaat、taaact、gaat或taaaat。
12、在本专利技术的一种实施方式中，将所述启动子pluxr-luxi中序列中的第167-172位的碱基ttacg替换为ttgaca、ttggat或aggattt。
13、在本专利技术的一种实施方式中，将所述启动子pluxr-luxi中序列中的第187-192位的碱基ttata替换为taaact，同时将第167-172位的碱基ttacg替换为aggattt；
14、在本专利技术的一种实施方式中，将所述启动子pluxr-luxi中序列中的第187-192位的碱基ttata替换为tacaat，同时将第167-172位的碱基ttacg替换为ttggat；
15、在本专利技术的一种实施方式中，所述启动子pluxr-luxi中序列中的第187-192位的碱基ttata替换为taaaat，同时将第167-172位的碱基ttacg替换为aggattt；
16、在本专利技术的一种实施方式中，所述启动子pluxr-luxi中序列中的第187-192位的碱基ttata替换为taaaat，同时将第167-172位的碱基ttacg替换为ttggat；
17、在本专利技术的一种实施方式中，所述目的蛋白包括不限于amyz1蛋白、invdz13蛋白、果聚糖酶39。
18、在本专利技术的一种实施方式中，所述amyz1蛋白为α-淀粉酶，所述amyz1蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示。
19、在本专利技术的一种实施方式中，所述蔗糖酶invdz13的氨基酸序列如seq id no.5所示。
20、在本专利技术的一种实施本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种自诱导表达载体，其特征在于，所述表达载体上连接有诱导模块和响应模块；所述诱导模块为含有核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的启动子PluxR-luxI、核苷酸序列为SEQ IDNO.2所示的LuxR基因、核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示的LuxI基因的luxR-luxI表达框，所述响应模块中含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的PR61启动子和目的蛋白。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，将所述启动子PluxR-luxI中序列中的第187-192位的碱基TTATA替换为TACAAT、TACAAT、TAAACT、GAAT或TAAAAT。
3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，将所述启动子PluxR-luxI中序列中的第167-172位的碱基TTACG替换为TTGACA、TTGGAT或AGGATTT。
4.根据权利要求1～3任一所述的表达载体，其特征在于，将所述启动子PluxR-luxI中序列中的第187-192位的碱基TTATA替换为TAAACT，同时将第167-172位的碱基TTACG替换为AGGATT
5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞中含有权利要求1～4任一所述的表达载体。
6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主；优选的，所述重组细胞是以枯草芽孢杆菌为表达宿主。
7.一种提高目的蛋白表达量的方法，其特征在于，所述方法为，采用权利要求1～4任一所述的表达载体或权利要求5或6所述的重组细胞进行目的蛋白的表达。
8.一种制备目的蛋白的方法，其特征在于，所述方法为，将权利要求5或6所述的重组细胞添加至培养基中发酵制备得到目的蛋白；优选的，所述目的蛋白包括不限于amyZ1蛋白、InvDz13蛋白、果聚糖酶39。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法为，将所述重组细胞经划线活化后，先接种于种子培养基中，于25～35℃、180～220rpm下培养8-10h，得到种子液；将种子液接种至摇瓶发酵培养基中，于25～35℃、180～220rpm下培养45～50h，制备得到目的蛋白。
10.权利要求1～4任一所述的表达载体，或权利要求5或6所述的重组细胞，或权利要求7～9任一所述的方法在制备目的蛋白及其在食品、医药、纺织领域中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种自诱导表达载体，其特征在于，所述表达载体上连接有诱导模块和响应模块；所述诱导模块为含有核苷酸序列如seq id no.8所示的启动子pluxr-luxi、核苷酸序列为seq idno.2所示的luxr基因、核苷酸序列为seq id no.3所示的luxi基因的luxr-luxi表达框，所述响应模块中含有核苷酸序列如seq id no.1所示的pr61启动子和目的蛋白。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，将所述启动子pluxr-luxi中序列中的第187-192位的碱基ttata替换为tacaat、tacaat、taaact、gaat或taaaat。
3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，将所述启动子pluxr-luxi中序列中的第167-172位的碱基ttacg替换为ttgaca、ttggat或aggattt。
4.根据权利要求1～3任一所述的表达载体，其特征在于，将所述启动子pluxr-luxi中序列中的第187-192位的碱基ttata替换为taaact，同时将第167-172位的碱基ttacg替换为aggattt；
5.一种重组细胞，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚动邦，汪斌，房伟，肖亚中，方泽民，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：
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