【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酪蛋白酶解物检测的，具体涉及一种酪蛋白酶解物中六肽和十肽的检测方法。
技术介绍
1、酪蛋白酶解物具有舒缓压力、改善睡眠的功效，研究发现，酪蛋白酶解物中包含食源性功能活性六肽(ypvepf)和十肽(ylgyleqllr)等，具有良好的抗焦虑、舒缓情绪、改善睡眠障碍的效果。六肽和十肽能够结合gabaa受体，打开“睡眠开关”，引起大脑中一系列神经递质变化，从而发挥改善睡眠的作用。并且通过动物及多次随机人群临床实验验证，证明六肽和十肽能够有效辅助缓解压力、焦虑情绪，改善睡眠障碍。
2、申请号为20098012076.2的中国专利中公开了一种富含芳香族氨基酸的改善睡眠酶解物及其制备方法，提出了酪蛋白酶解物六肽(ypvepf)和十肽(ylgyleqllr)制备方法及检测方法。但该专利中提及的检测方法仅针对工艺过程的酶解液，前处理方法过于复杂，并且需要使用高分辨质谱进行检测，仪器设备昂贵，并且是相对定量，不利于检测方法推广应用。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种酪蛋白酶解物中六肽和十肽的检测方法，本专利技术中使用三重四极杆低分辨质谱，建立一种简单、快速、准确、具有广泛实用性的酪蛋白酶解物产品中六肽(ypvepf)和十肽(ylgyleqllr)的检测方法。
2、为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了一种酪蛋白酶解物中六肽和十肽的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
4
5、进一步地，所述内标液为六肽同位素内标肽和十肽同位素内标肽的混合液；其中，六肽同位素内标肽为[13c5,15n]-六肽和[13c5,15n]-十肽；所述混合液中，所述六肽同位素内标肽的质量浓度为1～10μg/ml；所述十肽同位素内标肽的质量浓度为1～10μg/ml。
6、优选地，所述混合液中，所述六肽同位素内标肽的质量浓度为10μg/ml；所述十肽同位素内标肽的质量浓度为10μg/ml。
7、进一步地，所述样品前处理的步骤中，所述待测酪蛋白酶解物样品与水的质量体积比mg/ml为(0.05-5)：1；和/或所述样液和所述内标液的体积比为(2～8)：1。
8、优选地，所述样品前处理的步骤中，所述待测酪蛋白酶解物样品与水的质量体积比mg/ml为0.5：1；和/或所述样液和所述内标液的体积比为5：1。
9、进一步地，所述样品前处理的步骤中，所述样品前处理的步骤中，离心的转速为15000r/min-23000r/min；离心的时间为5min-10min；离心的温度为0-10℃。
10、进一步地，所述不同标准工作溶液的浓度为：所述六肽的浓度为0.25μg/ml～5.0μg/ml，所述十肽的浓度为0.25μg/ml～5.0μg/ml；所述六肽同位素内标肽的浓度为0.1μg/ml～20μg/ml，所述十肽同位素内标肽的浓度为0.1μg/ml～20μg/ml；且在不同浓度的标准溶液中，所述六肽同位素内标肽的浓度相同，所述十肽同位素内标肽的浓度也相同。
11、优选地，所述不同标准工作溶液的浓度为：所述六肽和十肽的浓度分别为0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml；所述六肽同位素内标肽和十肽同位素内标肽的浓度均为1μg/ml。
12、进一步地，所述高效液相色谱串联质谱仪中，所述质谱仪为三重四级杆低分辨质谱仪。
13、进一步地，所述高效液相色谱串联质谱仪采用的液相色谱条件为：
14、色谱柱：acquity uplc beh300 c18柱，2.1mm×100mm(i.d.)，1.7μm；
15、流动相a：0.1％甲酸水溶液；
16、流动相b：0.1％甲酸乙腈溶液；
17、流动相流速：0.3-0.5ml/min；
18、采用梯度洗脱；
19、柱温：30-40℃；
20、进样量：0.2-10μl。
21、进一步地，所述梯度洗脱的程序如表1所示：
22、表1
23、 时间(min) 流速(ml/min) a(％) b(％) 0 0.3 90 10 1.0 0.3 40 60 4.0 0.3 20 80 4.01 0.3 0 100 5.0 0.3 0 100 5.01 0.3 90 10 6.0 0.3 90 10
24、。
25、进一步地，所述高效液相色谱串联质谱仪采用的质谱分析条件为：
26、离子化模式：esi+；毛细管电压：3.0kv；脱溶剂温度：500℃；源温：150℃；脱溶剂气流量：800l/hr；碰撞室气流量：0.18ml/min；锥孔电压：23v。
27、进一步地，质谱分析得到的参数如表2所示：
28、表2
29、
30、*代表定量离子对。
31、本专利技术的上述技术方案的有本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种酪蛋白酶解物中六肽和十肽的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述内标液为六肽同位素内标肽和十肽同位素内标肽的混合液；
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述样品前处理的步骤中，所述待测酪蛋白酶解物样品与水的质量体积比mg/mL为(0.05-5)：1；和/或
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述样品前处理的步骤中，离心的转速为15000r/min-23000r/min；离心的时间为5min-10min；离心的温度为0-10℃。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述不同标准工作溶液的浓度为：
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱串联质谱仪中，所述质谱仪为三重四级杆低分辨质谱仪。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱串联质谱仪采用的液相色谱条件为：
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序如表1所示：
9.根
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，质谱分析得到的参数如表2所示：
...【技术特征摘要】
1.一种酪蛋白酶解物中六肽和十肽的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述内标液为六肽同位素内标肽和十肽同位素内标肽的混合液；
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述样品前处理的步骤中，所述待测酪蛋白酶解物样品与水的质量体积比mg/ml为(0.05-5)：1；和/或
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述样品前处理的步骤中，离心的转速为15000r/min-23000r/min；离心的时间为5min-10min；离心的温度为0-10℃。
5.根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：张立佳，莫楠，刘丽君，文静，白艳梅，高玉杰，李翠枝，
申请(专利权)人：内蒙古伊利实业集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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