本发明专利技术公开了一种在枯草芽孢杆菌中胞外表达β‑葡萄糖苷酶的方法，属于微生物学和生物工程技术领域。本发明专利技术实现了海洋微生物宏基因组来源的β‑葡萄糖苷酶在枯草芽孢杆菌中胞外分泌表达，并证明了其在枯草芽孢杆菌中是以非经典分泌途径进行胞外表达。然后，通过对β‑葡萄糖苷酶自身氨基酸序列中影响其分泌效率的关键疏水区域I266‑Q269进行改造，获得的突变体提高了β‑葡萄糖苷酶在枯草芽孢杆菌中的胞外表达水平，最终胞外β‑葡萄糖苷酶活性为1.42U/mL，是对照菌株的1.97倍。本发明专利技术将加深研究人员对枯草芽孢杆菌非经典分泌途径的理解，促进利用枯草芽孢杆菌非经典分泌途径高效表达目的蛋白。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种在枯草芽孢杆菌中胞外表达β-葡萄糖苷酶的方法，属于微生物学和生物工程。
技术介绍
1、β-葡萄糖苷酶(bgl,ec.3.2.1.21)是一种可以水解β-1，4糖苷键的酶，是纤维素分解酶系中重要成员，可以参与纤维素的代谢以及多种生理生化途径，被广泛应用于食品、造纸、纺织及医药等领域。
2、然而，由于β-葡萄糖苷酶表达水平低，造成其生产成本高昂严重限制了其在工业上的实际应用。
3、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)是一种革兰氏阳性菌，具有较强的蛋白分泌能力，遗传操作简单、无密码子偏好性以及发酵成本低等优点，已被开发为一种重要工业原核表达系统。由于其被美国食品和药物管理局列为原则上认为安全的微生物(gras)，其被广泛应用于食品和药品行业。
4、目前报道的b.subtilis主要分泌途径有4种，分别是sec型、tat型、abc转运途径、com途径。这4种分泌途径均由不同类型的信号肽所介导，也被称为经典分泌途径。其中，大多数蛋白质是通过sec和tat途径以未折叠或折叠的可转运构象从细胞质转运到胞外培养基中。
5、然而，一些蛋白利用由信号肽介导的经典分泌途径的胞外分泌效果并不理想，限制了其在枯草芽孢杆菌中的高效重组表达。
6、除经典分泌途径之外枯草芽孢杆菌中还存在一种不需要信号肽介导就可实现目的蛋白跨膜转运的分泌途径，这种不依赖信号肽的分泌途径称为非经典分泌途径。非经典分泌系统已在蛋白质生产中得到应用，同时也为重组蛋白的分泌提供了一种新的方法。</p>7、然而，目前对于非经典分泌途径的研究很少，该分泌机制尚不清楚，难以利用非经典分泌途径实现目的蛋白在枯草芽孢杆菌中的高效胞外表达。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术以海洋微生物宏基因组来源的β-葡萄糖苷酶bgl24297为目的蛋白，以pbep43为载体骨架，以枯草芽孢杆菌wb600(bacillus subtilis wb600)为表达宿主，实现了β-葡萄糖苷酶bgl24297在枯草芽孢杆菌中胞外分泌表达。比较了bgl24297在枯草芽孢杆菌中有信号肽及无信号肽介导下的胞外活性，同时测定了枯草芽孢杆菌中乳酸脱氢酶(ldh)活性，证明了bgl24297在枯草芽孢杆菌中是通过非经典分泌途径进行胞外分泌。然后，通过对β-葡萄糖苷酶bgl24297自身氨基酸序列中的疏水区域进行预测及缺失验证，确定了影响其分泌效率的β-葡萄糖苷酶自身关键疏水区域。最后，通过对关键疏水区域进行定点突变和随机突变获得一株β-葡萄糖苷酶在枯草芽孢杆菌中的胞外表达水平提高的突变体i267w/e268r/q269k，其胞外β-葡萄糖苷酶活性为1.42u/ml，是对照菌株的1.97倍。在本专利技术的一种实施方式中，所述的β-葡萄糖苷酶为来源于海洋微生物宏基因组的β-葡萄糖苷酶bgl24297及其突变体衍生序列。其中，β-葡萄糖苷酶bgl24297的氨基酸序列如seq id no.1所示，基因序列如seq id no.2所示。
2、seq id no.1：
3、mtkislptcsplltkefiygvatssfqieggsahrlpciwdtfcdtpgkiadnsnghvacdhynnwkqdidlieslgvdayrlsiswprvitksgelnpegvkfytdildelkkrnikafvtlyhwdlpqhledeggwlnretayafahyvdlitlafgdrvhsyatlnepfcsaflgyeigihapgkvgkqygrkaahhlllahglamtvlkqnspttlngivlnftpcysisedaddiaatafaddylnqwymkpimdgtypaiieqlpsahlpdihdgdmaiisqsidylginyytrqfykahpteiyepieptgpltdmgweiypksftellvtlnntytlppifitengaampdsynngeindvdrldyynshlnavhnateqgvridgyfawslmdnfewaegylkrfgivyvdystqqrtiknsglaykalisnr
4、seq id no.2：
5、atgactaaaatatctttaccaacttgttcacctctattaacaaaagagtttatttatggtgtagcaacatcatctttccaaatagaaggtggctcagctcaccgtctgccgtgt
6、atctgggataccttttgtgatactccaggtaaaatagctgataactcaaatgggcatgttgcatgcgatcattacaataattggaaacaagacatagatttaatcgaatcatt
7、aggagtagatgcttacagactttctatttcttggcctcgtgttattacaaaaagtggtgagcttaaccctgaaggcgtaaagttttacaccgacatcttagatgaactgaaaa
8、agcgcaatattaaagcgtttgtcacgttataccactgggatttacctcaacacctagaagacgaagggggttggttaaatcgagaaacagcttacgcgtttgctcactat
9、gttgatttaattaccttggcattcggtgaccgggtgcattcatacgctaccttaaacgaacccttttgcagtgcttttttaggttacgaaattggcattcatgcgccagggaa
10、agtcggcaaacaatacgggcgcaaagccgcccaccatttgttattagcacatggccttgccatgaccgtattaaagcaaaactcaccgacgactttaaacggtatcgtg
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12、catacccagcaattattgaacaattaccttcagcacatctgccagatattcacgatggtgacatggccattatttcacaatcaattgattatttaggtattaactattatacccg
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14、acacttaacaatacctataccctaccgcctatttttattactgaaaatggcgcagctatgcccgacagctataataa本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种β-葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第266位、第267位、第268位、第269氨基酸中的一个或多个进行突变后得到的。
2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第266位的异亮氨酸突变为谷氨酸得到的；
3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的重组载体。
5.表达权利要求1或2所述的突变体，或携带权利要求3所述基因，或携带权利要求4所述重组载体的重组细胞。
6.如权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以细菌或真菌为表达宿主。
7.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶或权利要求1或2所述的突变体。
8.一种提高β-葡萄糖苷酶酶的酶活或分泌量的方法，其特征在于，所述方法为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第266位的异亮氨酸突变为谷氨酸；
9.一种降解纤维素或木质素的方法，其特征在于，所述方法为，将权利要求1或2所述的突变体，或权利要求5或6所述的重组细胞添加至含有纤维素或木质素的反应体系中进行反应制备。
10.权利要求1或2所述的突变体，或权利要求3所述的基因，或权利要求4所述的重组载体，或权利要求5或6所述的重组细胞在制备β-葡萄糖苷酶或含有β-葡萄糖苷酶产品或在食品、工业、医药领域中的应用。
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【技术特征摘要】
1.一种β-葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如seq id no.1所示的β-葡萄糖苷酶的第266位、第267位、第268位、第269氨基酸中的一个或多个进行突变后得到的。
2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体为，将氨基酸序列如seq idno.1所示的β-葡萄糖苷酶的第266位的异亮氨酸突变为谷氨酸得到的；
3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的重组载体。
5.表达权利要求1或2所述的突变体，或携带权利要求3所述基因，或携带权利要求4所述重组载体的重组细胞。
6.如权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以细菌或真菌为表达宿主。
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【专利技术属性】
技术研发人员：肖亚中，王文静，姚动邦，李鹤，房伟，张学成，方泽民，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：
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