【技术实现步骤摘要】
本申请涉及疾病模型领域，更具体地说，它涉及一种模拟精神疾病患者的大脑皮层类器官及其构建方法和用途。
技术介绍
1、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，ipscs)是由体细胞诱导分化而成的“多能细胞”。ipscs在形态、基因表达、表观遗传修饰以及细胞自我更新等方面和胚胎干细胞(embryonic stem cells,escs)类似，具有分化为三种胚层的能力。由诱导多能干细胞定向诱导分化，可形成人脑器官模型，为精神疾病的体外研究提供了新的工具，目前多个研究团队已建立了孤独症、精神分裂、抑郁症、双相情感障碍、神经退行性疾病等的大脑类器官模型，促进了精神神经疾病发病机制和病理学、药物筛选等方面的进展。但目前未见紧张症类精神疾病器官模型的构建方法。
2、紧张症(catatonia)是一种精神运动性紊乱的临床综合征，包括运动、精神、行为和自主神经等方面的症状，包括木僵、强直、蜡样屈曲、缄默、违拗、故作姿势、作态、动作刻板、精神运动性激越、扮怪相、模仿言语和模仿动作等。在美国精神障碍诊断与统计手册第五版(dsm-5)中，紧张症作为单独的诊断被列出，包括了与其他精神障碍有关的紧张症、由于其他躯体疾病所致的紧张症和未特定的紧张症。
3、目前，对紧张症的发病机制尚不清楚。近年来有研究者基于患者的临床表现，将紧张症分为迟钝型、兴奋型、恶性紧张及精神运动自动症，并提出了神经递质理论假说，涉及γ-氨基丁酸能、谷氨酸能和多巴胺能神经元功能障碍，如中枢神经系统中谷氨酸能系统的过度活跃和γ-氨
4、目前紧张症的治疗方法包括苯二氮卓类药物和电痉挛疗法。但目前药物治疗对紧张症的改善与潜在的精神或躯体状况之间无明显联系；而电痉挛疗法对大脑发育有不利影响，出于伦理、安全等方面考虑，电痉挛疗法还存在诸多障碍。另外，目前紧张症的治疗仍建立在临床经验基础上，由于缺乏临床前动物和细胞模型，其生物学基础不明，导致针对紧张症的药物研发进展缓慢。
技术实现思路
1、为了促进紧张症的致病机理研究以及药物研发，本申请提供一种模拟精神疾病患者的大脑皮层类器官及其构建方法和用途。
2、本申请采用如下的技术方案：
3、第一方面，本申请提供一种紧张症的皮层类器官疾病模型的构建方法，其包括：
4、获取紧张症患者的生物样本，分离单核淋巴细胞，通过ipsc重编程构建紧张症患者来源的诱导多能干细胞系；
5、将所述诱导多能干细胞系进行扩增和传代培养，并诱导形成拟胚体；
6、将所述拟胚体依次在诱导培养基、分化培养基和前体培养基中进行培养，分化形成皮层类器官前体；
7、将所述皮层类器官前体在促成熟培养基中培养，得到皮层类器官疾病模型。
8、进一步地，上述通过ipsc重编程构建紧张症患者来源的诱导多能干细胞系的方法包括：
9、利用ips重编程试剂盒对扩增后的所述单核淋巴细胞进行电转，得到含有四种质粒载体的重组细胞，将所述重组细胞在含有丁酸钠的ips重编程培养基中进行重编程培养，直至出现克隆细胞。
10、进一步地，上述重编程培养的条件参数为：
11、培养温度为36-38℃，培养环境中氧气含量为1-3％；培养时间6-8天，且每隔1-2天换一次新鲜的所述ips重编程培养基。
12、进一步地，将所述诱导多能干细胞系诱导形成拟胚体的步骤包括：
13、将分化程度小于9-11％的所述诱导多能干细胞系消化成单细胞悬液，离心后，在含有rock抑制剂的mtesr1培养基中重悬，调整细胞浓度为5×104–1×105个细胞/ml，置于细胞培养板中进行拟胚体诱导培养。
14、进一步地，在将所述诱导多能干细胞系诱导形成拟胚体的步骤中，所述细胞培养板中每孔加入5000-10000个细胞/100μl，置于培养箱中培养，连续1-3天补加80-120μl/孔的拟胚体诱导培养液。
15、进一步地，所述拟胚体诱导培养液中含有mtesr1培养基、sb431542和多索吗啡。
16、进一步地，在分化形成所述皮层类器官前体的过程中:
17、所述诱导培养基、分化培养基和前体培养基均是以neurobasal培养基为基础并加入神经营养因子形成的；
18、所述诱导培养基中的神经营养因子包括b27-a、neaa(非必需氨基酸)、glutamaxtm、sb431542、多索吗啡；
19、所述分化培养基中的神经营养因子包括b27-a、neaa、glutamaxtm、表皮生长因子、以及成纤维细胞生长因子；
20、所述前体培养基中的神经营养因子包括b27-a、neaa、glutamaxtm、脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子、环磷酸腺苷和抗坏血酸。
21、进一步地，在将所述皮层类器官前体在促成熟培养基中培养过程中，所述促成熟培养基是以brainphys培养基为基础并加入b27形成的。
22、第二方面，本申请还提供一种根据上述构建方法获得的紧张症的皮层类器官疾病模型。
23、第三方面，本申请还提供一种上述紧张症的皮层类器官疾病模型在制备、筛选预防或治疗紧张症的药物中的应用。
24、综上所述，本申请具有以下有益效果：
25、本申请利用从已经确诊为紧张症的患者处获得的生物样本(例如皮肤、血液等细胞)，并分离人单核淋巴细胞，通过重编程获得紧张症患者来源的ipsc干细胞系，其中携带患者本身的整套缺陷遗传物质，随后诱导该多能干细胞系经过类胚体形成、神经上皮扩张、神经元分化、迁移和成熟等过程，可以获得紧张症患者来源的、类似人脑细胞组成和结构的，具有神经细胞电活动功能的紧张症大脑类器官。
26、本申请通过进行sanger测序、免疫荧光、rna测序、电活动检测等进行验证，表明已成功构建紧张症临床前疾病模型，其能够反映紧张症患者脑组织的生理病理生物学特征，为紧张症的药物筛选以及致病机理研究提供了一个全新的模型。同时，本申请还发现病人的noxo1基因发生突变、蛋白质含明显降低，可能造成noxo1功能的丧失，由此说明该疾病模型可用于研究noxo1突变对大脑发育的影响，并用于基于noxo1突变引起的紧张症药物研发。
27、该方法突破了人脑组织获取困难、紧张症这类精神疾病缺乏临床前模型的局限性，并且通过构建患者来源的诱导多能干细胞系，最后得到的皮层类器官疾病模型更能反映紧张症患者的真实生理、病理生物学特征，为紧张症的发病机制研究和药物筛选提供了新工具。
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1.一种紧张症的皮层类器官疾病模型的构建方法，其特征在于，其包括：
2.根据权利要求1所述的紧张症的皮层类器官疾病模型的构建方法，其特征在于，通过iPSC重编程构建紧张症患者来源的诱导多能干细胞系的方法包括：
3.根据权利要求2所述的紧张症的皮层类器官疾病模型的构建方法，其特征在于，所述重编程培养的条件参数为：
4.根据权利要求1所述的紧张症的皮层类器官疾病模型的构建方法，其特征在于，将所述诱导多能干细胞系诱导形成拟胚体的步骤包括：
5.根据权利要求4所述的紧张症的皮层类器官疾病模型的构建方法，其特征在于，在将所述诱导多能干细胞系诱导形成拟胚体的步骤中，所述细胞培养板中每孔加入5000-10000个细胞/100 μL，置于培养箱中培养，连续1-3天补加80-120μL/孔的拟胚体诱导培养液。
6.根据权利要求5所述的紧张症的皮层类器官疾病模型的构建方法，其特征在于，所述拟胚体诱导培养液中含有mTeSR1培养基、SB431542和多索吗啡。
7.根据权利要求1所述的紧张症的皮层类器官疾病模型的构建方法，其特征在
8.根据权利要求1所述的紧张症的皮层类器官疾病模型的构建方法，其特征在于，在将所述皮层类器官前体在促成熟培养基中培养过程中，所述促成熟培养基是以Brainphys培养基为基础并加入B27形成的。
9.一种根据权利要求1-8任一项所述的构建方法获得的紧张症的皮层类器官疾病模型。
10.一种根据权利要求9所述的紧张症的皮层类器官疾病模型在制备、筛选预防或治疗紧张症的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种紧张症的皮层类器官疾病模型的构建方法，其特征在于，其包括：
2.根据权利要求1所述的紧张症的皮层类器官疾病模型的构建方法，其特征在于，通过ipsc重编程构建紧张症患者来源的诱导多能干细胞系的方法包括：
3.根据权利要求2所述的紧张症的皮层类器官疾病模型的构建方法，其特征在于，所述重编程培养的条件参数为：
4.根据权利要求1所述的紧张症的皮层类器官疾病模型的构建方法，其特征在于，将所述诱导多能干细胞系诱导形成拟胚体的步骤包括：
5.根据权利要求4所述的紧张症的皮层类器官疾病模型的构建方法，其特征在于，在将所述诱导多能干细胞系诱导形成拟胚体的步骤中，所述细胞培养板中每孔加入5000-10000个细胞/100 μl，置于培养箱中培养，连续1-3天补加80-120μl/...
【专利技术属性】
技术研发人员：卜迁，岑小波，况伟宏，张霓，边国慧，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：
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