【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及秋石斛胚性愈伤组织诱导及再生，具体地说，涉及一种秋石斛胚性愈伤组织诱导及再生的组培方法。
技术介绍
1、秋石斛(phalaenopsis-type dendrobium)花姿优美，形似纷飞的蝴蝶，花色丰富，喜欢在高温、多湿、阳光充足的热带环境中生长和开花，花期长且主要集中在秋冬季，是我国花卉市场常见的盆栽及切花植物。海南省因具有得天独厚的地理优势，已发展为我国秋石斛的主产区。近年来，秋石斛盆花在海南的栽种面积逐年扩大，据统计，海南每年出货量达到500万盆以上，占广州该类花卉市场份额95％以上。
2、秋石斛常用组织培养方法是以种子播种获得原球茎，以类原球茎为外植体，即通过器官发生途径获得转基因植株；由于原球茎已处于分化阶段，因此该方法获得纯合转基因植株相对困难。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种秋石斛胚性愈伤组织诱导及再生的组培方法，其能够克服现有技术的某种或某些缺陷。
2、根据本专利技术的一种秋石斛胚性愈伤组织诱导及再生的组培方法，其具体包括以下步骤：
3、步骤s1、选取秋石斛的成熟果荚进行消毒处理，获得消毒后的果荚；然后将消毒后的果荚置于无菌平皿中，切开果荚，用无菌手术刀将秋石斛种子取出；
4、步骤s2、将所述种子接种至种子培养基，经过培养后，获得无菌苗；
5、步骤s3、将所述无菌苗的茎段接种到诱导培养基中，在25-28℃黑暗条件下进行诱导培养30-40天，获得胚性愈伤组织；
6、步骤s4
7、步骤s5、在所述增殖的胚性愈伤组织中选取嫩黄致密、生长状态一致的胚性愈伤组织接种到所述分化培养基中，在25-28℃光照条件下进行分化培养30天，获得不定芽；
8、步骤s6、将生长茁壮、体型良好的不定芽接种到所述生根培养基中，在25-28℃光照条件下进行生根培养30天，获得秋石斛幼苗。
9、作为优选，步骤s1中的所述消毒处理具体包括以下步骤：取秋石斛的成熟果荚置于无菌组培瓶中，2％ naclo3消毒15min，无菌水清洗3-5遍；转入95％乙醇润洗2-3s后用酒精灯烧去多余乙醇，重复该步骤2-3次。
10、作为优选，步骤s2中所述种子培养基的组成为：1/2ms+3g/l花宝1号+2g/l蛋白胨+0.5g/l活性炭+30g/l蔗糖+8g/l卡拉胶；所述无菌苗的培养方法为：步骤s2中的所述培养具体包括以下步骤：以种子培养基在25-28℃、光照强度100μmol/m2/s、光照时间16小时/天条件下，对所述秋石斛种子培养30天获得原球茎，2-3个月后获得2-3叶期无菌苗。
11、作为优选，步骤s3中所述诱导培养基的组成为：msd+0.1-2mg/l 2,4-d+0.5mg/lkt；msd的组成为：ms+30g/l葡萄糖+1g/l花宝1号+8g/l琼脂。
12、作为优选，诱导培养基中2,4-d的浓度为0.2-0.5mg/l。
13、作为优选，步骤s4中所述增殖培养基的组成为：msd+0.1-0.5mg/l 2,4-d+0.1-0.5mg/l kt；msd的组成为：ms+30g/l葡萄糖+1g/l花宝1号+8g/l琼脂。
14、作为优选，增殖培养基的组成为：msd+0.5mg/l iba+0.5mg/l kt。
15、作为优选，步骤s5中所述分化培养基的组成为：1/2ms+30mg/l glu谷氨酰胺+1g/l花宝+8g/琼脂+0.5mg/l iba+0.15mg/l kt或1/2ms+30mg/l glu谷氨酰胺+1g/l花宝+8g/琼脂+3mg/l 6-ba+1mg/l naa。
16、作为优选，分化培养基的组成为1/2ms+30mg/l glu谷氨酰胺+1g/l花宝+8g/琼脂+0.5mg/l iba+0.15mg/l kt为最优。
17、作为优选，步骤s6中的所述生根培养基的组成为：1/2ms+30g/l蔗糖+0.5mg/l naa+8g/l琼脂；1/2ms+30g/l蔗糖+0.5mg/l naa+0.5mg/lkt+8g/l琼脂。
18、作为优选，生根培养基的组成为1/2ms+30g/l蔗糖+0.5mg/l naa+8g/l琼脂为最优。
19、作为优选，步骤s3中所述诱导培养和s4中所述增殖培养的培养条件均为：湿度为70-80％，25-28℃暗培养；步骤s5中所述分化培养和步骤s6中所述生根培养的培养条件均为：湿度为70-80％，光照时间为16小时/天，光照强度为100μmol/m2/s。
20、本专利技术还提供一种秋石斛胚性愈伤组织诱导及再生的培养基，其用于前述的一种秋石斛胚性愈伤组织诱导及再生的组培方法；其包括诱导培养基、增殖培养基、分化培养基、生根培养基。
21、作为优选，所述诱导培养基的组成为：msd+0.1-2mg/l 2,4-d+0.5mg/l kt；msd的组成为：ms+30g/l葡萄糖+1g/l花宝1号+8g/l琼脂；
22、所述增殖培养基的组成为：msd+0.1-0.5mg/l 2,4-d+0.1-0.5mg/l kt；msd的组成为：ms+30g/l葡萄糖+1g/l花宝1号+8g/l琼脂；
23、所述分化培养基的组成为：1/2ms+30mg/l glu谷氨酰胺+1g/l花宝+8g/琼脂+0.5mg/l iba+0.15mg/l kt或1/2ms+30mg/l glu谷氨酰胺+1g/l花宝+8g/琼脂+3mg/l 6-ba+1mg/l naa；
24、所述生根培养基的组成为：1/2ms+30g/l蔗糖+0.5mg/l naa+8g/l琼脂；1/2ms+30g/l蔗糖+0.5mg/l naa+0.5mg/l kt+8g/l琼脂。
25、相对于现有技术，本专利技术具有以下显著的进步：
26、(1)本专利技术建立了以秋石斛胚性愈伤组织诱导及再生的组织培养体系，相比原球茎，胚性愈伤组织作为转基因外植体无需经过脱分化；可直接将外源基因转入干细胞分化为转基因幼胚，以再生形成完整植株。该转化途径能够有效地避免转基因嵌合体植株的产生，能够作为较为理想的转化受体细胞。从而能够为今后开展细胞生物学研究，以及开展分子育种提供了技术支撑。
27、(2)本专利技术根据秋石斛的生长特性，在ms培养基的基础上配置出适合秋石斛组织培养的诱导培养基、增殖培养基、分化培养基和生根培养基。本专利技术的诱导培养基、增殖培养基、分化培养基和无菌生根培养基适用于几种秋石斛，如“迷你”、“水蜜桃”和“三亚阳光”等；具有一定的广谱性。
28、(3)以‘迷你’品种为例，当本专利技术中的组培方法应用于‘迷你’品种的秋石斛时，将果荚消毒后接种于苗培养基，待原球茎和幼苗形成后，手术刀处理原球茎或去除幼苗叶片与根部取幼茎为外植体，放入本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种秋石斛胚性愈伤组织诱导及再生的组培方法，其特征在于：其具体包括以下步骤，
2.根据权利要求1所述的一种秋石斛胚性愈伤组织诱导及再生的组培方法，其特征在于：步骤S1中的所述消毒处理具体包括以下步骤：取秋石斛的成熟果荚置于无菌组培瓶中，2％NaClO3消毒15min，无菌水清洗3-5遍；转入95％乙醇润洗2-3s后用酒精灯烧去多余乙醇，重复该步骤2-3次。
3.根据权利要求1所述的一种秋石斛胚性愈伤组织诱导及再生的组培方法，其特征在于：步骤S2中所述种子培养基的组成为：1/2MS+3g/L花宝1号+2g/L蛋白胨+0.5g/L活性炭+30g/L蔗糖+8g/L卡拉胶；所述无菌苗的培养方法为：步骤S2中的所述培养具体包括以下步骤：以种子培养基在25-28℃、光照强度100μmol/m2/s、光照时间16小时/天条件下，对所述秋石斛种子培养30天获得原球茎，2-3个月后获得2-3叶期无菌苗。
4.根据权利要求1所述的一种秋石斛胚性愈伤组织诱导及再生的组培方法，其特征在于：步骤S3中所述诱导培养基的组成为：MSD+0.1-2mg/L2,4-D+0.
5.根据权利要求1所述的一种秋石斛胚性愈伤组织诱导及再生的组培方法，其特征在于：步骤S4中所述增殖培养基的组成为：MSD+0.1-0.5mg/L2,4-D+0.1-0.5mg/L KT；MSD的组成为：MS+30g/L葡萄糖+1g/L花宝1号+8g/L琼脂。
6.根据权利要求1所述的一种秋石斛胚性愈伤组织诱导及再生的组培方法，其特征在于：步骤S5中所述分化培养基的组成为：1/2MS+30mg/L Glu+1g/L花宝+8g/琼脂+0.5mg/LIBA+0.15mg/L KT或1/2MS+30mg/L Glu+1g/L花宝+8g/琼脂+3mg/L 6-BA+1mg/L NAA。
7.根据权利要求1所述的一种秋石斛胚性愈伤组织诱导及再生的组培方法，其特征在于：步骤S6中的所述生根培养基的组成为：1/2MS+30g/L蔗糖+0.5mg/L NAA+8g/L琼脂；1/2MS+30g/L蔗糖+0.5mg/L NAA+0.5mg/LKT+8g/L琼脂。
8.根据权利要求1所述的一种秋石斛胚性愈伤组织诱导及再生的组培方法，其特征在于：步骤S3中所述诱导培养、步骤S4中所述增殖培养的培养条件均为：湿度为70-80％，25-28℃暗培养；步骤S5中所述分化培养、步骤S6中所述生根培养的培养条件均为：湿度为70-80％，光照时间为16小时/天，光照强度为100μmol/m2/s。
9.一种秋石斛胚性愈伤组织诱导及再生的培养基，其特征在于：用于权利要求1-8任一所述的一种秋石斛胚性愈伤组织诱导及再生的组培方法；其包括诱导培养基、增殖培养基、分化培养基、生根培养基。
10.根据权利要求9所述的一种秋石斛胚性愈伤组织诱导及再生的培养基，其特征在于：
...【技术特征摘要】
1.一种秋石斛胚性愈伤组织诱导及再生的组培方法，其特征在于：其具体包括以下步骤，
2.根据权利要求1所述的一种秋石斛胚性愈伤组织诱导及再生的组培方法，其特征在于：步骤s1中的所述消毒处理具体包括以下步骤：取秋石斛的成熟果荚置于无菌组培瓶中，2％naclo3消毒15min，无菌水清洗3-5遍；转入95％乙醇润洗2-3s后用酒精灯烧去多余乙醇，重复该步骤2-3次。
3.根据权利要求1所述的一种秋石斛胚性愈伤组织诱导及再生的组培方法，其特征在于：步骤s2中所述种子培养基的组成为：1/2ms+3g/l花宝1号+2g/l蛋白胨+0.5g/l活性炭+30g/l蔗糖+8g/l卡拉胶；所述无菌苗的培养方法为：步骤s2中的所述培养具体包括以下步骤：以种子培养基在25-28℃、光照强度100μmol/m2/s、光照时间16小时/天条件下，对所述秋石斛种子培养30天获得原球茎，2-3个月后获得2-3叶期无菌苗。
4.根据权利要求1所述的一种秋石斛胚性愈伤组织诱导及再生的组培方法，其特征在于：步骤s3中所述诱导培养基的组成为：msd+0.1-2mg/l2,4-d+0.5mg/l kt；msd的组成为：ms+30g/l葡萄糖+1g/l花宝1号+8g/l琼脂。
5.根据权利要求1所述的一种秋石斛胚性愈伤组织诱导及再生的组培方法，其特征在于：步骤s4中所述增殖培养基的组成为：msd+0.1-0.5mg/l2,4-d+0.1-0.5mg/l kt；msd的组成为：m...
【专利技术属性】
技术研发人员：李亚梅，尹俊梅，李志晴，李崇晖，郭玉华，林妃，康勇，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，
类型：发明
国别省市：
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