【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及链酶亲和突变的突变蛋白，经突变后能够可逆结合生物素，因此能够用于蛋白纯化，再生后并重复利用。
技术介绍
1、链霉亲和素(即streptavidin)对生物素(biotin)具有超强的非共价结合力，野生型链霉亲和素结合生物素的解离平衡常数kd在10-14mol/l，是目前自然界中已知的最强非共价相互作用，因此在分子生物学领域具有广泛运用，其应用领域包括：亲和层析、活细胞荧光成像、蛋白组学、生物素化酶的固定等。虽然链霉亲和素应用领域很广，但是具体到每一个应用，对链霉亲和素的性质更为细化的要求，例如亲和层析要求较低的亲和力和较高的解离常数，才能有效地将目的分子从含有链霉亲和素的微球上洗脱。由于野生型链霉亲和素会和生物素(biotin)修饰的蛋白结合非常牢固，需要在非常剧烈的条件下，在含有高浓度的生物素(biotin)的缓冲溶液中95℃加热才能将部分蛋白洗脱下来，因此其不能用于对生物素(biotin)修饰的蛋白进行非变性亲和层析；野生型链霉亲和素的亲和纯化应用是利用其与长度为38个氨基酸的肽段sbp(氨基酸序列mdekttgwrgghvveglageleqlrarlehhpqgqrep)的强亲和力，解离平衡常数kd为10-9mol/l，将sbp肽段作为亲和纯化标签融合于目的蛋白n段或c端，并用biotin进行竞争洗脱，但该应用的缺点仍在于biotin与野生型链霉亲和素超强的结合力，导致野生型链霉亲和素无法有效再生，限制了sbp标签的应用。为了扩大对链霉亲和素的应用范围，需要对链霉亲和素进行改造以减弱其与biotin的结合力
2、voss等对链霉亲和素的44-47位氨基酸突变得到streptactin突变体(44-47位氨基酸具有以下序列：val-thr-ala-arg，野生型链霉素亲和素在15位至139位的截短序列)，其能特异性结合短肽strep tagⅱ(肽段序列：trp-ser-his-pro-gln-phe-glu-lys)，其结合strep tagⅱ的解离平衡常数kd在10-7mol/l，但其对生物素的解离平衡常数kd仍在10-11～10-12mol/l，使得其与biotin的结合仍不可逆；wong等将野生型链霉亲和素的27位的丝氨酸(ser)突变为丙氨酸(ala)(s27a)，48位的甘氨酸(gly)突变为苏氨酸(thr)(g48t)得到savsbpm18突变体，该突变体对biotin的解离平衡常数kd升高10-8mol/l，使得biotin与savsbpm18的结合变得可逆。
3、由于sbp标签长度较长，因此其应用有限，目前应用最广的是streptactin与strep标签，但是单独的strep tagⅱ与streptactin结合仍然不够强，因此实际使用过程中将两个strep tagⅱ串联(即twinstrep标签，肽段序列：trp-ser-his-pro-gln-phe-glu-lys-(gly-gly-gly-ser)3-trp-ser-his-pro-gln-phe-glu-lys，其编码的核苷酸如seq idno.1所示，氨基酸序列如seq id no.2所示)使得解离平衡常数kd达到10-9mol/l，大大增强其结合力。然而streptactin在用于纯化strep tagⅱ标签的融合蛋白时，仍然具有以下缺点，特别是用生物素洗脱后会造成streptactin难以再生使用，并且用变性剂、强酸、强碱等进行重生，降低其使用寿命；洗脱目的蛋白时常常使用较为昂贵的脱硫生物素代替生物素对目的蛋白进行洗脱(schmidt et al，2007)，但因为脱硫生物素的价格远高于生物素，使用浓度较高，所以又造成了使用成本上升，不利于工业生产。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供链霉亲和素野生型链酶亲和素的44-47位氨基酸为vtar，以及第27位丝氨酸突变的突变蛋白s27v；本专利技术的目的之二在于提供含有所述链霉亲和素第27位丝氨酸突变的突变蛋白的固定复合物；本专利技术的目的之三在于提供所述链霉亲和素第27位丝氨酸突变的突变蛋白或所述固定复合物在纯化strep tagⅱ标签或twinstrep标签蛋白中的应用；本专利技术的目的之四在于提供所述链霉亲和素突变蛋白或所述固定复合物在纯化生物素修饰蛋白中的应用；本专利技术之五在于提供利用所述链霉亲和素第27位丝氨酸突变的突变蛋白纯化strep tagⅱ标签或twinstrep标签蛋白的方法；本专利技术目的之六在于提供利用所述链霉亲和素第27位丝氨酸突变的突变蛋白纯化生物素修饰蛋白的方法。
2、为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、1、链霉亲和素第27位丝氨酸突变的突变蛋白s27v，所述突变蛋白为野生型链酶亲和素第44至47位氨基酸残基为vtar，以及在野生型链酶亲和素的第27位丝氨酸突变为缬氨酸，记为s27v；氨基酸序列如seq id no.34所示。
4、2、所述链霉亲和素第27位丝氨酸突变的突变蛋白s27v与微球的固定复合物。
5、3、所述链霉亲和素第27位丝氨酸突变的突变蛋白s27v或所述固定复合物在纯化strep tagⅱ标签或twinstrep标签蛋白中的应用。
6、4、所述链霉亲和素第27位丝氨酸突变的突变蛋白s27v或所述交联复合物在纯化生物素修饰蛋白中的应用。
7、5、利用1所述链霉亲和素第27位丝氨酸突变的突变蛋白s27v纯化strep tagⅱ标签或twinstrep标签蛋白的方法，将表达含strep tagⅱ标签或twinstrep标签蛋白的裂解液与所述突变蛋白的固定复合物结合，用缓冲液冲洗，最后用5-10mm biotin缓冲液洗脱，收集洗脱液。
8、6、所述链霉亲和素第27位丝氨酸突变的突变蛋白s27v纯化strep tagⅱ标签或twinstrep标签蛋白的方法，biotin缓冲液洗脱后还包括再生利用，具体为：向纯化过streptagⅱ标签或twinstrep标签蛋白的固定复合物加入缓冲液洗涤即可再次使用。
9、本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了所述链霉亲和素第27位丝氨酸突变的突变蛋白s27v，将野生型链酶亲和素第27位的丝氨酸(ser)突变成不同氨基酸的突变体，突变后的蛋白与strep tagⅱ结合力增加，提高了其对strep和twinstrep融合蛋白的纯化能力，同时与biotin的结合减弱，使得biotin与其作用变得可逆，洗脱后进行洗涤再生可再次利用，因此能够更好的用于biotin修饰蛋白和strep tagⅱ标签蛋白纯化，用biotin对生物素修饰的蛋白进行洗脱，洗脱后用缓冲液对streptactin mut进行洗涤再生即可再次利用。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.链霉亲和素第27位丝氨酸突变的突变蛋白S27V，其特征在于：所述突变蛋白为野生型链酶亲和素第44至47位氨基酸残基为VTAR，以及在野生型链酶亲和素的第27位丝氨酸突变为缬氨酸，记为S27V；氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示。
2.权利要求1所述链霉亲和素第27位丝氨酸突变的突变蛋白S27V与微球的固定复合物。
3.权利要求1所述链霉亲和素第27位丝氨酸突变的突变蛋白S27V或权利要求2所述固定复合物在纯化Strep tagⅡ标签或Twinstrep标签蛋白中的应用。
4.权利要求1所述链霉亲和素第27位丝氨酸突变的突变蛋白S27V或权利要求2所述交联复合物在纯化生物素修饰蛋白中的应用。
5.利用权利要求1所述链霉亲和素第27位丝氨酸突变的突变蛋白S27V纯化Strep tagⅡ标签或Twinstrep标签蛋白的方法，其特征在于：将表达含Strep tagⅡ标签或Twinstrep标签蛋白的裂解液与所述突变蛋白的固定复合物结合，用缓冲液冲洗，最后用5-10mMBiotin缓冲液洗脱，收集洗脱液。
6.根据权利
...【技术特征摘要】
1.链霉亲和素第27位丝氨酸突变的突变蛋白s27v，其特征在于：所述突变蛋白为野生型链酶亲和素第44至47位氨基酸残基为vtar，以及在野生型链酶亲和素的第27位丝氨酸突变为缬氨酸，记为s27v；氨基酸序列如seq id no.34所示。
2.权利要求1所述链霉亲和素第27位丝氨酸突变的突变蛋白s27v与微球的固定复合物。
3.权利要求1所述链霉亲和素第27位丝氨酸突变的突变蛋白s27v或权利要求2所述固定复合物在纯化strep tagⅱ标签或twinstrep标签蛋白中的应用。
4.权利要求1所述链霉亲和素第27位丝氨酸突变的突变蛋白s27v或权利要求2所述交联复合物在纯化生物素修饰蛋白中...
【专利技术属性】
技术研发人员：李洪涛，邬文峰，金瑞，何红梅，杨婧，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：
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