【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种在灰盖鬼伞中高效同源重组表达担子菌漆酶的方法，属于基因工程及发酵工程领域。
技术介绍
1、漆酶(laccase,ec 1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，它能以水为唯一副产物氧化酚类、羧酸类、芳香胺类化合物及其衍生物等，被认为是一种具有重要工业应用的绿色催化剂。
2、因此，漆酶被广泛用于各种行业，从环境领域到化妆品行业，包括食品加工和纺织行业(染料生物降解和合成)。
3、漆酶基因在自然界中分布广泛，存在于植物、昆虫、细菌和真菌的基因组中，迄今发现的漆酶中有80％以上来自真菌。其中，来源于担子菌的漆酶因其底物范围广、比活性高、还原潜力大等优势成为应用最广泛的漆酶，占目前漆酶市场份额的90％以上，且市场需求量大。
4、因此，高效制备担子菌来源的漆酶具有巨大的应用前景。
5、然而，担子菌天然分泌漆酶的产量和效率相对较低。例如，在25℃的mkjalke培养基中培养6d后，灰盖鬼伞的胞外漆酶活性最高仅为3.5u/ml。前期常将担子菌漆酶在子囊酵母和丝状子囊菌(如曲霉菌)中进行异源重组表达已实现其高效生产。然而，与担子菌天然分泌的漆酶相比，由于子囊酵母和丝状子囊菌中不合理的翻译后修饰，如不完全折叠和过度糖基化，造成获得的重组漆酶在包括蛋白质分子量、氧化还原电位、ph稳定性和热稳定性等在内的酶学性质方面发生改变。这严重降低了由子囊酵母和丝状子囊菌异源重组表达所获得的重组漆酶的实际应用价值。
6、上述缺陷均使得来源于担子菌的漆酶在工业上难以得到广泛的应用。>
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种在灰盖鬼伞中高效同源重组表达担子菌漆酶的方法。此方法以pysk7为表达载体、以来源于灰盖鬼伞的漆酶基因为目的基因、以灰盖鬼伞fa2222(coprinopsis cinerea fa2222)为表达宿主，构建同源重组表达漆酶的灰盖鬼伞重组菌。然后，挖掘c.cinerea fa2222基因组中的关键几丁质酶基因，并利用rna干扰技术(rnainterference,rnai)对其进行沉默，最后对获得的灰盖鬼伞重组菌进行发酵优化。利用此灰盖鬼伞工程菌可高效同源重组表达漆酶，将其作为生产菌株，发酵5d后发酵液中的漆酶活性为38.2u/ml。
2、本专利技术提供了一种高效同源重组表达漆酶的重组灰盖鬼伞(coprinopsiscinerea)，所述重组灰盖鬼伞过表达了氨基酸序列如seq id no.1所示的漆酶，所述漆酶为来源于c.cinerea fa2222的漆酶lcc5基因。
3、seq id no:1：漆酶lcc5的氨基酸序列
4、msfawkalatlavaiasrsafaqsiignqdtmtisninagpdgftrpviavngefpsplvrankgddfrinvvnnldddtmlrqtsvhwhgvfqhqsawadgpdgvtqcpipqsgqefeyafnagqeagtfwyhshygtqycdglrgplviydpedphqdlydvddentiitladwyhlqapsiqgpavsqatlingkgrrpgstegdiavvnvekdsryrfrivslscdpdytfsidnhtmtiieadgqntkplevesirvfagqrysvvvnadqaignywiraepnigdtglvgtsgggvnsailryatadevepdtprltnrpalqesnlraltsgvpggdgpaditftfnlglnfatgtfsmnpgeswvhpdtpvmvqimngvpaedlvpaeslhtitrgqvvevvippfgiagphpfhlhghafsviksaggspnfvdpvrrdvvavgteagqgdtiirfvadnpgpwffhchiefhlvtglaavfmeapdeiassnppppswdalcpafsalppsatsirivptptp
5、在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体为pysk7；所述表达宿主为c.cinereafa2222。
6、本专利技术提供了一种高效同源重组表达漆酶的重组灰盖鬼伞(coprinopsiscinerea)，所述重组灰盖鬼伞过表达了氨基酸序列如seq id no.1所示的漆酶，同时使其基因组上的几丁质酶不表达；所述不表达为基因缺失、敲除或沉默，所述漆酶为来源于c.cinerea fa2222的漆酶lcc5基因。
7、在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体为pysk7；所述表达宿主为c.cinereafa2222。
8、在本专利技术的一种实施方式中，所述几丁质酶基因为来源于c.cinerea fa2222基因组中的几丁质酶基因chien1和chie2。
9、在本专利技术的一种实施方式中，所述几丁质酶基因chien1和chie2的氨基酸序列为seq id no.2和seq id no.3所示。
10、seq id no.2：几丁质酶基因chien1的氨基酸序列
11、mqfktsffallagflasstlaayvpvadsvpdndsltapdcthdgsttttapagdavvpvpaepdsevrlnatqvlasldaggkvatawypswqaaahppeslswdkynamtfafatttsdpanplaldaesqallpkfveqakqhnvkallslggwtgsiyfsdhvstperrtafvkavvdlatqynldgidfdwefpnkqgigcnhisnadsanflaflqelrqdptggklmltaavgllpfvgsdgqpmsdvsgfaevfdfiaimaydvwgawsptvgpnaplqdscaangvgsvassvaawtgagfpanklvlgvpaygrsyyvdpanalsaageltpyaqfdkskqplgegetgeqtvdqcgvasgpsglfnfaglvdagylnpdgtaaegmvylcdqcsetpfvyqkdtgtmityddaestaakgnfiaeqglkgfaiwhgigdyndilldavsrgmgq
12、seq id no.3：几丁质酶基因chie2的氨基酸序列
13、mgtalwlflsfalvatssfadhppsgkkhrrraeipfrieppfhplssspapsiistsgldsptstslspvtftaahqrstapgrpdlpvviqgdslkilphpgsgtqrsdsitgsgaqatdtpsnplplfmgyypdwaadtfppesldygrydwidfafavptaefglewdsddapnvltrlvtsahlsrckvklsiggwtgskyfstavstsqsrqlfasnilsvysrynldgidldweypghegnrgniydhsdtlnfldflillrdtlppsaritvaaqtfpftdqngeplsdsspfasvldwvlimnydtw本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea)，其特征在于，所述重组灰盖鬼伞过表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的漆酶；或所述重组灰盖鬼伞过表达了氨基酸序列如SEQID NO.1所示的漆酶，同时使其基因组上的几丁质酶不表达；所述不表达为基因缺失、敲除或沉默。
2.根据权利要求1所述的重组灰盖鬼伞，其特征在于，所述几丁质酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1或2所述重组灰盖鬼伞，其特征在于，所述重组灰盖鬼伞是以灰盖鬼伞FA2222为宿主细胞。
4.氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示几丁质酶在提高重组灰盖鬼伞中的漆酶的表达量中的应用，其特征在于，所述重组灰盖鬼伞过表达了氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的漆酶，同时使其基因组上的几丁质酶不表达；所述不表达为基因缺失、敲除或沉默。
5.一种在灰盖鬼伞中高效同源重组表达担子菌漆酶的方法，其特征在于，所述方法为，在灰盖鬼伞宿主细胞中过表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的漆酶，或过
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述几丁质酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.3所示。
7.一种生产漆酶的方法，其特征在于，所述方法为采用权利要求1～3任一项所述的重组灰盖鬼伞发酵制备得到的。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法为，将所述重组灰盖鬼伞先接种于种子培养平板中，于35～38℃下静置培养6～10d，得到种子菌丝块，然后将种子菌丝块接种至种子液体培养基中，于35～38℃、100～140rpm下培养3～5d，得到种子菌丝体，再将种子菌丝体在3000～4000rpm下匀浆10～20s，得到种子液，最后将种子液接种至发酵培养基中，于35～38℃、100～140rpm下培养4～6d。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分包含18～22g/L的葡萄糖，8～12g/L的酵母膏，0.4～0.6g/L的氯化钙，1～3g/L的磷酸二氢钾，48～52g/L的硫酸镁。
10.权利要求1～3任一项所述的重组灰盖鬼伞或权利要求5～9任一项所述的方法在制备漆酶、或在处理氧化酚类、羧酸和芳胺化合物及其衍生物方面的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种重组灰盖鬼伞(coprinopsis cinerea)，其特征在于，所述重组灰盖鬼伞过表达了氨基酸序列如seq id no.1所示的漆酶；或所述重组灰盖鬼伞过表达了氨基酸序列如seqid no.1所示的漆酶，同时使其基因组上的几丁质酶不表达；所述不表达为基因缺失、敲除或沉默。
2.根据权利要求1所述的重组灰盖鬼伞，其特征在于，所述几丁质酶的氨基酸序列如seq id no.2或seq id no.3所示。
3.根据权利要求1或2所述重组灰盖鬼伞，其特征在于，所述重组灰盖鬼伞是以灰盖鬼伞fa2222为宿主细胞。
4.氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示几丁质酶在提高重组灰盖鬼伞中的漆酶的表达量中的应用，其特征在于，所述重组灰盖鬼伞过表达了氨基酸序列如seq idno.1所示的漆酶，同时使其基因组上的几丁质酶不表达；所述不表达为基因缺失、敲除或沉默。
5.一种在灰盖鬼伞中高效同源重组表达担子菌漆酶的方法，其特征在于，所述方法为，在灰盖鬼伞宿主细胞中过表达了氨基酸序列如seq id no.1所示的漆酶，或过表达了氨基酸序列如seq id no.1所示的漆酶，同时使其基因组上的几丁质酶不表达；...
【专利技术属性】
技术研发人员：方泽民，姚动邦，麻宇婷，刘娟娟，张学成，肖亚中，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：
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