【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的质粒及其构建方法、应用。
技术介绍
1、细菌感染(bacterial infection)是致病菌或条件致病菌侵入血循环引起的急性全身性感染，对人类健康、畜牧业等都有不同程度的威胁。而在治疗细菌感染与动物养殖的过程中，由于抗菌药物的滥用，细菌抗生素耐药性的形成加速，导致多重耐药菌(multipledrug resistant organism，mdro)的产生并使细菌感染带来的死亡负担加重。细菌耐药性已成为全球人口公共卫生的巨大威胁，在中国的形势尤其十分严峻，给患者的救治带来了严重的挑战，阐明耐药性发生与传播的机制并基于机制研发耐药性干预策略刻不容缓。直接分离自临床、动物、环境一线的多重耐药菌是开展机制研究的最佳对象，然而在此类多重耐药菌中开展机制研究的最大障碍是高效基因编辑技术的缺失。
2、crispr(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是原核生物基因组内的一段重复序列，是细菌和病毒等入侵dna长期竞争中进化产生的适应性免疫系统。由其专利技术的crispr-cas基因编辑系统目前被广泛地运用在真核生物的基因编辑中。但是目前与crispr-cas相关的基因编辑技术都是基于结构简单的ii类系统所开发，运用在不同条件下存在基因编辑的周期长、脱靶、对质粒编辑因涉及dna双键断裂易造成质粒容易丢失等问题，因此目前仍极少应用于多重耐药菌的基因编辑。因此，由于缺乏能在多重耐药
3、依赖于同源重组的传统基因编辑技术可将含有目的基因两侧同源序列的外源dna片段导入宿主菌，然后通过核酸链间等位替换的方式对目的基因进行进行快速、高效、精确的修饰和编辑，但目前基于此原理的方法在多重耐药菌中的使用依然罕见。因此，专利技术一种分离自不同来源的多重耐药菌基于同源重组实现单碱基分辨率基因编辑的方法至关重要。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于设计提供了针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的质粒及其构建方法、应用的技术方案，本专利技术以plgge质粒为基础，而该质粒前体系统由r6kγ复制起点、多重筛选标记基因、多克隆位点区、其他调控元件四部分核心基因元件构成，在多克隆位点区插入目的基因待编辑处两侧的同源片段实现完整功能性质粒的构建，利用供体菌e.coligedpir将plgge质粒接合转移至受体野生菌中，在特定抗生素筛选压力下进行目标基因待编辑处两侧的同源片段的重组，获得整合子菌株后进行sacb介导的逆向筛选，经测序验证后获得无痕编辑目标基因的突变株，此方法可以大大提高对多重耐药阴性菌基因编辑的效率，减少时耗且应用前景广泛。
2、本专利技术具体采用以下技术方案实现：
3、本专利技术第一方面提供了一种针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的质粒，所述的质粒上设有蔗糖致死基因sacb，用于逆向筛选；
4、所述质粒上设有抗菌素抗性标记基因；
5、所述质粒上设有编码绿色荧光蛋白sfgfp的基因sfgfp，具有更好的折叠性与稳定性，在基因编辑的多个阶段辅助克隆筛选；
6、所述质粒上设有m13同源臂克隆位点，用于插入感兴趣的基因；
7、所述质粒上设有r6kγorigin，缺失复制关键蛋白π的编码基因pir，r6kγorigin只能在特定的可以提供π蛋白的菌株中复制，在非pir+菌株中无法复制，仅携带r6kγorigin的质粒会成为自杀质粒；
8、所述质粒上设有orit，用于接合转移；
9、所述质粒上设有启动子、核糖体结合位点和终止子。
10、进一步，所述抗菌素抗性标记基因包括卡那霉素抗性标记基因kanr、潮霉素抗性标记基因hygr中的至少一种。
11、进一步，所述质粒上设有启动子bba_j23105、核糖体结合位点t7-gene-10rbs和终止子bba_b1001、bba_b1002。
12、其中，启动子bba_j23105、核糖体结合位点t7-gene-10rbs，具有相对较强的启动活性，提供组成型表达；终止子bba_b1001阻断sacb基因和sfgfp基因的泄漏表达，降低质粒适应性代价；终止子bba_b1002阻断上下游插入片段中启动子的转录，降低sacb基因因这些启动子驱动过表达带来的细胞毒性。
13、本专利技术第二方面提供了一种针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的质粒的构建方法，其包括如下步骤：
14、s1：以含有蔗糖致死基因sacb的质粒为模板，扩增得到蔗糖致死基因sacb片段；
15、s2：以含有sfgfp基因的的质粒为模板，扩增得到sfgfp片段；
16、s3：以含有抗菌素抗性标记的质粒为模板，扩增得到抗菌素抗性标记基因片段；
17、s4：以pkng101质粒为模板，扩增得到orit以及r6kγorigin片段；
18、s5：利用特定引物，扩增得到m13同源臂克隆位点片段、sacb与m13同源臂克隆位点片段的衔接片段；
19、s6：通过gibson连接将上述片段与启动子、终止子按序连接，无缝克隆组装得到所述的用于靶点基因及片段编辑的带有逆向筛选标记的plgge质粒；
20、s7：将构建好的plgge连接产物转化至e.coligedpir感受态细胞中筛选、验证得到供体菌株e.coli gedpirplgge。
21、进一步，所述plgge质粒的受体菌为大肠杆菌。
22、本专利技术第三方面提供了上述的质粒在针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑中的应用。
23、进一步，该应用具体包括如下步骤：
24、s01：利用引物扩增得到靶点基因上、下游同源臂，将以e.coligedpirplggeh基因组dna为模板扩增的plggeh骨架片段连接并转化至e.coligedpir感受态细胞，筛选、验证得到供体菌株；
25、s02：将供体菌和受体菌混合培养后进行涂菌，筛选在抗生素抗性平板上能够正常生长且显绿色荧光的菌株，并进行菌落pcr验证，得到正确编辑的整合子菌株；
26、s03：将整合子菌株在不含有抗生素，含有蔗糖的培养基中，在30～40℃培养，筛选在含有蔗糖的平板上生长，且不显绿色荧光的的菌株，并进行菌落pcr验证，得到候选突变菌株；
27、s04：使用引物对候选突变菌株扩增，并将本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的质粒，其特征在于，所述的质粒上设有蔗糖致死基因sacB，用于逆向筛选；
2.如权利要求1所述的一种针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的质粒，其特征在于，所述抗菌素抗性标记基因包括卡那霉素抗性标记基因kanR、潮霉素抗性标记基因hygR中的至少一种。
3.如权利要求1所述的一种针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的质粒，其特征在于，所述质粒上设有启动子BBa_J23105、核糖体结合位点T7-gene-10RBS和终止子BBa_B1001、BBa_B1002。
4.如权利要求1所述的质粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述pLGGE质粒的受体菌为大肠杆菌。
6.如权利要求1-3任一所述的质粒在针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，具体包括如下步骤：
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，培养基中蔗糖的含量为6～12％。
【技术特征摘要】
1.一种针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的质粒，其特征在于，所述的质粒上设有蔗糖致死基因sacb，用于逆向筛选；
2.如权利要求1所述的一种针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的质粒，其特征在于，所述抗菌素抗性标记基因包括卡那霉素抗性标记基因kanr、潮霉素抗性标记基因hygr中的至少一种。
3.如权利要求1所述的一种针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的质粒，其特征在于，所述质粒上设有启动子bba_j23105、核糖体结合位点t7-gene-1...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘广宇，范程枫，范梅梅，陈凤，高佳歆，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：
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