针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的质粒及其构建方法、应用技术

本发明专利技术涉及针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的质粒及其构建方法、应用。本发明专利技术的质粒以R6Kγorigin自杀复制子为基础，设有蔗糖致死基因sacB用于逆向筛选，并有绿色荧光蛋白基因sfgfp、卡那霉素抗性基因kanR或潮霉素抗性基因hygR供基因编辑的多个阶段筛选；辅以同源臂克隆位点以及一系列调控元件。该方法通过构建与目标碱基或基因上下游序列相同的DNA片段实现同源重组以及sacB、sfgfp、kanR等基因筛选获得目标菌株，克服了目前针对多重耐药阴性菌基因编辑耗时长、效率低的问题。本发明专利技术可根据目标菌株耐药情况理性选择质粒携带的抗性基因，拓宽了编辑范围，且解决了CRISPR相关系统DNA双键断裂导致质粒丢失的问题，在多重耐药菌的机制研究与资源利用中有着广阔的前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程，具体涉及针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的质粒及其构建方法、应用。

技术介绍

1、细菌感染(bacterial infection)是致病菌或条件致病菌侵入血循环引起的急性全身性感染，对人类健康、畜牧业等都有不同程度的威胁。而在治疗细菌感染与动物养殖的过程中，由于抗菌药物的滥用，细菌抗生素耐药性的形成加速，导致多重耐药菌(multipledrug resistant organism，mdro)的产生并使细菌感染带来的死亡负担加重。细菌耐药性已成为全球人口公共卫生的巨大威胁，在中国的形势尤其十分严峻，给患者的救治带来了严重的挑战，阐明耐药性发生与传播的机制并基于机制研发耐药性干预策略刻不容缓。直接分离自临床、动物、环境一线的多重耐药菌是开展机制研究的最佳对象，然而在此类多重耐药菌中开展机制研究的最大障碍是高效基因编辑技术的缺失。

2、crispr(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是原核生物基因组内的一段重复序列，是细菌和病毒等入侵本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的质粒，其特征在于，所述的质粒上设有蔗糖致死基因sacB，用于逆向筛选；

2.如权利要求1所述的一种针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的质粒，其特征在于，所述抗菌素抗性标记基因包括卡那霉素抗性标记基因kanR、潮霉素抗性标记基因hygR中的至少一种。

3.如权利要求1所述的一种针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的质粒，其特征在于，所述质粒上设有启动子BBa_J23105、核糖体结合位点T7-gene-10RBS和终止子BBa_B1001、BBa_B1002。

4.如权利要求1所述的质粒的构建方...

【技术特征摘要】

1.一种针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的质粒，其特征在于，所述的质粒上设有蔗糖致死基因sacb，用于逆向筛选；

2.如权利要求1所述的一种针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的质粒，其特征在于，所述抗菌素抗性标记基因包括卡那霉素抗性标记基因kanr、潮霉素抗性标记基因hygr中的至少一种。

3.如权利要求1所述的一种针对多重耐药革兰氏阴性菌高精确度基因编辑的质粒，其特征在于，所述质粒上设有启动子bba_j23105、核糖体结合位点t7-gene-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘广宇，范程枫，范梅梅，陈凤，高佳歆，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：