本发明专利技术公开了一种与甜瓜白粉病抗性基因Ｐｍ－２Ｆ紧密连锁的特异片段，属于生物技术领域，其如序列表ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：２和４所示。本发明专利技术的优点是：本发明专利技术获得的ＳＳＲ特异片段具有重复性好，标记稳定可靠，便于统计等优点，其特异扩增序列亦是开发其它特异标记的基础，并且在鉴别抗、感病品种时有非常高的利用价值。
【技术实现步骤摘要】
本申请为下述专利申请的分案申请：申请号：200710178022.7申请日：2007年11月23日专利技术名称：与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段及其获得方法
本专利技术涉及与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段及其获得方法，属于生物
技术介绍
甜瓜为葫芦科黄瓜属(Cucumis melo L.)一年生蔓生草本植物，是一种国内外广泛栽培的重要经济作物。我国已有3000多年的甜瓜栽培历史，是世界上最早栽培甜瓜的国家之一，也是目前世界上甜瓜栽培面积最大、产量最高的国家。白粉病是危害甜瓜生产的一种世界性病害，在许多国家和地区都有发生，严重影响甜瓜的产量和品质，甚至会造成绝产，引起了世界各国的广泛重视。白粉病主要由瓜单囊壳菌(Sphaerotheca fuliginea)和二孢白粉菌(Erysiphe cichoracearum)引起。目前人们已较深入地对病原菌的致病性、传播途径、预防措施等进行了研究，也为寻找相关抗源基因做了大量工作，但白粉病菌的危害还是有不断发展的趋势，开展抗病品种的选育是解决这一问题的有效途径。因此，对瓜类白粉病抗病育种的研究已成为育种工作的主要目标之一。传统育种方式费时费力，需要非常大的群体对白粉病菌的抗性进行严格筛选。利用与抗病性状紧密连锁的特异标记片段进行品种筛选，可大大缩短传统育种的研究周期，加速目标基因的转移。目前，与抗病性状紧密连锁的特异标记片段的获得主要来源于各种分子标记技术，如随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、微卫星DNA或简单重复序列(SSR)、特异序列扩增(SCAR)、单核苷酸多态性(SNP)等。其中，RAPD和AFLP标记技术检测易受环境条件的影响而造成实验结果重现性差，SCAR和SNP标记技术需要利用已知DNA序列设计特异引物进行扩增，而SSR标记技术具有重复性好，标记稳定可靠，便于统计等优点，是目前实际应用中比较稳定的标记工具，而且利用SSR标记技术获得的特异片段序列也是开发SCAR和SNP等其他分子标记的重要基础。因此，本项研究拟利用SSR标记技术寻找与甜瓜白粉病抗性基因紧密连锁的特异标记片段，这将是今后进行甜瓜白粉病抗性分子育种的基础，而由此获得的扩增序列又是开发SCAR和SNP等特异分子标记的基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段，-->该特异片段可用于甜瓜抗白粉病分子标记辅助育种中。本专利技术的另一个目的是提供这种特异片段的获得方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段，其具有序列表中SEQ ID NO：1～4所述的DNA序列。序列表中SEQID NO：1为抗病特异扩增片段SSR509-172的序列；序列表中SEQ ID NO：2为抗病特异扩增片段SSR510-98的序列；序列表中SEQ ID NO：3为感病特异扩增片段SSR509-170的序列；序列表中SEQ ID NO：4为感病特异扩增片段SSR510-104的序列。一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段的获得方法，所述方法包括如下步骤：(1)与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段的筛选：提取基因组DNA，使用SSR引物对基因组DNA进行PCR反应，对PCR产物进行电泳分析；通过BSA法，寻找与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异SSR片段，测定连锁距离并验证连锁关系；(2)与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异扩增序列的获得：对SSR产物进行回收、克隆和测序，获得特异片段序列。上述的一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段的获得方法，所述步骤(1)中SSR引物为SSR引物509和SSR引物510；所述SSR引物509上游引物序列为：5’-CTGGCCCCCTCCTAAACTAA-3’，509下游引物序列为5’-CAAAAAGCATCAAAATGGTTG-3’。所述SSR引物510上游引物序列为：5’-TTTCACTTTTTCCCGCCG-3’，510下游引物序列为5’-AATGGAAAAGGGAAGTGCAA-3’。上述的一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段的获得方法，其中，所述步骤(1)中的提取基因组DNA是指将1.5克叶片在液氮中研磨成粉末，加入9ml 2％CTAB提取液，混匀65℃水浴1小时；从水浴中取出离心管，加1/3体积5M醋酸钾，混匀冰浴20分钟；加入等体积氯仿/异戊醇抽提两次；取上清加入2/3体积异丙醇沉淀DNA；洗涤缓冲液洗涤一次，吹干，加TE缓冲液溶解；加入RNase A使其终浓度达100μg/ml，混匀37℃水浴1小时；用等体积氯仿/异戊醇抽提；取上清，加入1/2体积7.5M醋酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀DNA；70％乙醇洗涤沉淀，吹干，加适量ddH2O溶解DNA。上述的一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段的获得方法，其中，所述步骤(1)中的PCR反应条件是：25μl的反应体系中含有2.5μl 10×buffer，2.0μl 25mM MgCl2，2.0μl 2.5mM dNTP，1U TaqDNA聚合酶，30ng SSR引物，50ng模板DNA；反应程序为，94℃预变性5min，然后94℃1min，52℃1min，72℃2min下循环35次，72℃延伸7min后保存在4℃条件下。上述的一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段的获得方法，其中，所述步骤(2)中的SSR产物的回收、克隆和测序是指用Gene-Clean试剂盒纯化回收已证明是连锁的SSR特异片段，然后连接到pGEM@-T Vector Easy载体上，将重组质粒DNA用EcoRI进行酶切处理，用SSR-PCR验证扩增产物，观察扩增出的片段是否与原来的目的片段和酶切片段一致，并测序。-->本专利技术应用简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)技术，在甜瓜重组自交系(Recombinant Inbred Line，RIL)群体中采用混合分组分析法(Bulked Segregating Analysis，BSA)筛选了与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的SSR特异片段，并将SSR特异片段克隆测序获得了特异扩增序列。本专利技术的优点是：本专利技术获得的SSR特异片段具有重复性好，标记稳定可靠，便于统计等优点，其特异扩增序列亦是开发其它特异标记的基础。下面结合附图及最佳实施方式对本专利技术做进一步说明，以使公众对
技术实现思路
有整体和充分的了解，而并非对本专利技术保护范围的限定。前述部分已经充分公开了本专利技术可以实施的保护范围，因此凡依照本专利技术公开内容进行的任何本领域公知的等同替换，均属于对本专利技术的侵犯。附图说明图1为引物SSR509和510对抗感亲本、F1、抗感池DNA扩增结果图；图2为引物SSR509对重组自交系群体的PCR扩增结果图；图3为引物SSR510对重组自交系群体的PCR扩增结果图；图4为引物SSR509对甜瓜种质资源的PCR扩增结果图；图5为引物SSR510对甜瓜种质资源的PCR扩增结果图。具体实施方式实施例与甜瓜白粉病抗性基因Pm-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种与甜瓜白粉病抗性基因Ｐｍ－２Ｆ紧密连锁的特异片段，其特征在于，其如序列表ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２和ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４所示。
【技术特征摘要】
1.一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段，其特征在于，其如序列表SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示。2.一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段的获得方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段的筛选：提取基因组DNA，使用SSR引物对基因组DNA进行PCR反应，对PCR产物进行电泳分析；通过BSA法，寻找与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异SSR片段，测定连锁距离并验证连锁关系；(2)与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异扩增序列的获得：对SSR产物进行回收、克隆和测序，获得特异片段序列。所述步骤(1)中SSR引物为SSR引物510；所述SSR引物510上游引物序列为：5’-TTTCACTTTTTCCCGCCG-3’，510下游引物序列为5’-AATGGAAAAGGGAAGTGCAA-3’。3.根据权利要求2所述的一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段的获得方法，其特征在于，所述步骤(1)中的提取基因组DNA是指将1.5克叶片在液氮中研磨成粉末，加入9ml 2％CTAB提取液，混匀65℃水浴1小时；从水浴中取出离心管，加1/3体积5M醋酸钾，混匀冰浴20分钟；加入等体积氯仿/异戊醇抽提两次；取上清加入2/3体...
【专利技术属性】
技术研发人员：张海英，许勇，苏芳，郭绍贵，宫国义，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：11
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