【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及癌症药物，特别涉及一种用于mycn扩增型rb的抑制剂及抑制效果验证方法。
技术介绍
1、视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，rb)是儿童最常见的眼部恶性肿瘤，全球每16,000至18,000名活产婴儿中即有1名罹患者。rb好发于5岁以下的婴幼儿及学龄前儿童，确诊年龄中位数为2岁。如果疾病处于早期且及时干预，则该病可治愈。但若未及时治疗，疾病发展至晚期，则通常会因眼眶、脑部和远处转移而预后较差。rb1是最早发现的抑癌基因，其缺失是rb产生的重要原因之一，但也有部分rb患者基因中没有rb1的改变，仅存在mycn的明显扩增。mycn扩增型rb约占所有rb患者的7％，mycn的扩增与肿瘤的不良预后密切相关。这类rb的特征是诊断年龄更小(4-5个月)、肿瘤体积更大、更容易转移，且组织学上缺少rb特有的玫瑰花环结构。
2、研究发现在mycn扩增的肿瘤中存在mycn-skp2-p27轴，即mycn的过表达会诱导skp2的表达，从而促使原本抑制细胞周期蛋白的p27被降解，消除其对细胞周期的抑制，从而导致细胞不断分裂形成恶性肿瘤。因此，在mycn扩增型rb中，可通过靶向mycn以达到抑制肿瘤生长的目的。
3、目前已有多种靶向mycn的方法被提出，但也存在一些问题。主要方法包括利用sirna干扰其mrna的功能、利用高通量筛选的方法寻找可以靶向mycn或mycn-max复合物的化学分子、crispr基因敲除技术、中药有效成分治疗等。有研究发现mycn基因的扩增会同时导致其基因附近序列的扩增，继而通过沉
4、因此，目前亟需一种用于mycn扩增型rb的抑制剂及抑制效果验证方法，解决现有的药物或方法治疗mycn扩增型rb的效果不佳的问题。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于：提供一种用于mycn扩增型rb的抑制剂及抑制效果验证方法，解决现有的药物或方法治疗mycn扩增型rb的效果不佳的问题。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
3、本专利技术一方面提供了一种用于mycn扩增型rb的抑制剂，该抑制剂为thz1。
4、本专利技术另一方面提供了一种用于mycn扩增型rb的抑制剂的抑制效果验证方法，应用于验证上述一种用于mycn扩增型rb的抑制剂中所述thz1的抑制效果，通过体外实验和体内实验验证抑制剂thz1对mycn扩增型rb具有抑制效果。
5、进一步的，体外实验包括：
6、选择有mycn扩增的rb细胞株y79和weri-rb-1以及视网膜色素上皮细胞株arpe-19作为正常对照；
7、设置thz1给药组和二甲亚砜溶剂对照组，使用逆转录酶实时荧光定量聚合酶链反应并检测cdk7、mycn、细胞周期相关分子的转录量变化情况；
8、利用细胞增殖及毒性检测试剂盒检测thz1对细胞增殖和毒性的影响，并计算半数抑制浓度用于后续功能探究实验；
9、利用流式细胞仪、细胞周期和细胞凋亡试剂盒检测不同浓度thz1对rb细胞周期和凋亡的影响；
10、再利用蛋白质印迹法检测多个thz1浓度作用24h后cdk7、pol ii的2、5、7丝氨酸磷酸化位点蛋白表达量的变化情况以及上述多个浓度在不同作用时间下mycn蛋白表达量的变化情况，并进行灰度半定量分析；
11、使用细胞免疫荧光技术检测thz1作用于两种rb细胞后，mycn蛋白和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记阳性率变化情况。
12、进一步的，所述给药组设置有4组，各个给药组中thz1的浓度分别为0.05、0.1、0.2和0.5μm。
13、进一步的，多个浓度的不同作用时间为6、12和24h。
14、进一步的，体内实验包括：
15、利用有mycn扩增的人源rb细胞株y79，构建小鼠皮下移植瘤模型,移植瘤模型包括实验组和对照组，每组各6只小鼠；
16、待肿瘤形成至100-150mm，连续21天行腹腔给药thz1，对照组给予相同体积的溶剂，并每隔三天测量一次小鼠体重和肿瘤体积；
17、给药周期结束后小鼠行安乐死，解剖并测量肿瘤体积，利用免疫组化结合半定量分析探究thz1对相关蛋白表达量的影响。
18、本专利技术与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
19、1.thz1可以在体外抑制mycn扩增型rb细胞的生长、促进其凋亡，且干扰细胞周期。
20、2.thz1可以在体内抑制mycn扩增型rb肿瘤的生长且药物副作用小，在体内也降低了转录相关分子的表达，抑制了增殖并促进了细胞凋亡，靶向ses组分cdk7有希望成为治疗mycn扩增型rb的一种选择。
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1.一种用于MYCN扩增型RB的抑制剂，其特征在于，该抑制剂为THZ1。
2.一种用于MYCN扩增型RB的抑制剂的抑制效果验证方法，应用于验证权利要求1所述一种用于MYCN扩增型RB的抑制剂中所述THZ1的抑制效果，其特征在于，通过体外实验和体内实验验证抑制剂THZ1对MYCN扩增型RB具有抑制效果。
3.根据权利要求2所述的一种用于MYCN扩增型RB的抑制剂的抑制效果验证方法，其特征在于，体外实验包括：
4.根据权利要求3所述的一种用于MYCN扩增型RB的抑制剂的抑制效果验证方法，其特征在于，所述给药组设置有4组，各个给药组中THZ1的浓度分别为0.05、0.1、0.2和0.5μM。
5.根据权利要求3所述的一种用于MYCN扩增型RB的抑制剂的抑制效果验证方法，其特征在于，多个浓度的不同作用时间为6、12和24h。
6.根据权利要求3所述的一种用于MYCN扩增型RB的抑制剂的抑制效果验证方法，其特征在于，体内实验包括：
【技术特征摘要】
1.一种用于mycn扩增型rb的抑制剂，其特征在于，该抑制剂为thz1。
2.一种用于mycn扩增型rb的抑制剂的抑制效果验证方法，应用于验证权利要求1所述一种用于mycn扩增型rb的抑制剂中所述thz1的抑制效果，其特征在于，通过体外实验和体内实验验证抑制剂thz1对mycn扩增型rb具有抑制效果。
3.根据权利要求2所述的一种用于mycn扩增型rb的抑制剂的抑制效果验证方法，其特征在于，体外实验包括：
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【专利技术属性】
技术研发人员：许瀚月，闫乃红，张明，肖丽蓉，陈怡，满姝蕾，李雅婷，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：
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