【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种用于预防肺炎球菌感染及rsv感染的肺炎球菌多糖-rsv重组蛋白结合疫苗及其制备方法。
技术介绍
1、肺炎球菌（streptococcus pneumoniae）是一种革兰氏阳性菌，细菌外膜由一层荚膜多糖包裹，依据不同荚膜多糖化学结构的不同，并以特异性抗血清进行分类，现发现有91种不同血清型肺炎球菌。该细菌可以引起多种疾病，对人类健康构成严重威胁。肺炎、发热性菌血症和脑膜炎是侵袭性肺炎球菌病最常见的表现，而细菌在呼吸道内传播可导致中耳炎、鼻窦炎或复发性支气管炎。与侵袭性疾病相比，非侵入性疾病通常不严重，但更为常见。
2、在欧洲和美国，肺炎球菌性肺炎是最常见的社区性细菌性肺炎，每年每10万名成年人中约有100人感染。发热性菌血症和脑膜炎分别为每10万名成年人中约有15-19人和每10万人1-2人感染。在婴幼儿和老年人以及任何年龄的免疫缺陷者中，出现其中一种或多种这些疾病的风险要高很多。即使在经济发达地区，侵袭性肺炎球菌导致的疾病死亡率也很高；患有肺炎球菌性肺炎的成人的死亡率约为10-20％，而高危人群的死亡率可能超过50％。据世界卫生组织(who)数据显示，每年全球有约150万人死于肺炎球菌感染，其中包括数百万的儿童。肺炎是迄今世界范围内导致肺炎球菌感染者死亡的最常见原因。
3、在中国，65岁以上老年人的肺炎发病率为1.6％(每10万名成年人中约有1600人)，随着年龄的增长，肺炎的发病率急剧上升，75岁以上老年人肺炎的发病率高达11.6％；老年人不仅仅肺炎发病率高，感染肺炎后
4、目前，针对肺炎球菌感染的预防措施主要包括接种疫苗和使用抗生素。然而，由于抗生素的广泛使用，肺炎球菌对抗生素的耐药性逐年上升，使得抗生素在治疗肺炎球菌感染方面的效果受到严重影响。因此，研发新型疫苗成为预防肺炎球菌感染的重要途径。
5、当前已上市的肺炎球菌疫苗主要有两种：肺炎球菌多糖疫苗和多糖结合疫苗，如23价肺炎球菌多糖疫苗(ppsv23)和13价肺炎球菌结合疫苗(pcv13)。虽然目前预防肺炎球菌感染的疫苗产品已经向多价多糖结合疫苗方向开发，不同厂商生产的pcv13也使用了不同的载体蛋白。例如，美国辉瑞生产的沛儿13使用的载体蛋白为无毒白喉类毒素突变体（crm197），而国产云南沃森生产的沃安欣使用的载体蛋白为破伤风类毒素（tt）。另外，国产北京民海生产的维民菲宝则使用了破伤风类毒素和白喉类毒素突变体双载体蛋白。但是，这些结合疫苗有一个共同的不足之处，就是载体蛋白没有赋予免疫原性的保护功能；也就是说，尽管结合疫苗载体能够刺激机体产生抗体，但疫苗设计者并没有能够利用载体蛋白产生的抗体来预防疾病，同时这些疫苗并不能覆盖所有的肺炎球菌血清型，并且接种后需要多次加强免疫，其保护效果仍有待提高。
6、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，rsv)是一种常见的病毒，主要通过空气传播，是婴幼儿下呼吸道感染的主要病原体。rsv感染可导致轻度至重度的呼吸道疾病，包括支气管炎、肺炎、哮喘发作等。尤其对于早产儿、低出生体重儿和免疫系统较弱的儿童，rsv感染可能导致严重的并发症，甚至死亡。
7、据统计，2019年全球rsv相关的急性下呼吸道感染次数高达3300万人次，因rsv所致的急性下呼吸道感染住院次数和死亡病例分别为360万人次、26300例；在0-6月龄的婴儿中，rsv所致急性下呼吸道感染发生次数、住院次数及住院死亡病例分别约为660万人次、140万人次、13300例。其中，中国是因rsv 导致儿童罹患急性下呼吸道感染人数较多的国家之一,而全球因rsv急性下呼吸道感染住院的5岁以下患儿中,99%的死亡病例来自发展中国家。成年人的rsv感染率随年龄的增加而升高,老年人是易感人群之一，且老年感染者的预后较差、经济负担较重,65岁以上老年人的住院病死率最高,每年每10万人中约有7.2万人死于rsv感染,且发展中国家患者的rsv感染病死率达9.1%。
8、rsv是一种有包膜的非节段性单股负链rna病毒，属于单胞病毒目、肺炎病毒科、正肺病毒属。其基因组由编码11种蛋白（包括9种结构蛋白（3种糖蛋白和6种内部蛋白）和2种非结构蛋白）的单链负义rna分子组成。结构蛋白包括3种跨膜表面糖蛋白：附着蛋白g、融合蛋白f和小疏水sh蛋白。存在两种rsv亚型：a和b，其差异主要在于g糖蛋白，而f糖蛋白的序列在两种亚型之间更保守。
9、rsv融合蛋白（f蛋白）属于i类跨膜蛋白，由574个氨基酸残基组成。在宿主细胞内最初生成为f蛋白的前体f0，f0蛋白在高尔基体上糖基化，随后通过细胞内弗林蛋白酶水解释放出27个氨基酸组成的多肽pep27，在该肽段的n和c端切割位点分别产生f1和f2两个亚基，f2亚基由信号肽sp和七肽重复序列hrc组成，f1亚基由融合肽fp、七肽重复区hra和hrb、domain i和domain ii跨膜区tm以及胞质域cp组成，f1和f2通过二硫键连接，形成一个异二聚体。三个异二聚体组装成一个成熟的f蛋白三聚体。rsv f蛋白三聚体不稳定，存在融合前(prefusion)和融合后(postfusion)两种构象。在病毒包膜表面的f蛋白最初为亚稳态的pre-f构象，当病毒吸附到细胞膜表面后，pre-f蛋白在细胞受体、温度和离子浓度等因素的触发下，其构象发生改变，生成高度稳定的post-f三聚体，该过程释放能量，可介导病毒包膜与细胞膜发生融合。由于pre-f的构象高度不稳定，因此，在体外分离纯化得到的蛋白通常为post-f。但研究表明亚稳态的pre-f构象是病毒介导膜融合过程所必需，也是诱导人体产生免疫应答的重要抗原。
10、对于具有高感染率、高重症发病率及死亡率的rsv感染，尚无针对rsv的特效药物。疫苗开发的一个主要障碍是20世纪60年代临床试验中使用福尔马林灭活（fi）rsv疫苗的疫苗强化疾病的遗留问题。fi-rsv接种疫苗的儿童未能免受自然感染的影响，并且受感染的儿童比未接种疫苗的儿童患有更严重的疾病，其中包括两人死亡。这种现象被称为“强化疾病”。自从使用fi-rsv疫苗进行试验以来，已经开始探索产生rsv疫苗的各种方法。尝试包括rsv的经典活减毒冷传代的或温度敏感性突变株、(嵌合的)蛋白亚单位疫苗、脑疫苗和由重组病毒载体(包括腺病毒载体)表达的rsv蛋白。尽管这些疫苗中的一些显示出有希望的临床前数据，但在保护效果、安全性及稳定性等方面仍有许多不足之处。因此，研究新型rsv疫苗具有重要意义。
11、pref蛋白作为rsv的主要抗原之一，具有较好的免疫原性。但是由于天然的pref蛋白在高温、高压、重金属离子、氧化剂、极端ph等条件下容易遭到破坏，蛋白结构稳定性差，难以保证其较好的抗原性，因此需要根据对pref蛋白结构和功能作进一步研究。研究表明对pref蛋白进行氨基酸突变修饰，可提高其免疫原性和稳定性。然而，如何获得稳定且高表达本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种RSV重组蛋白，其特征在于，所述的RSV重组蛋白是经过氨基酸突变修饰稳定性增强的RSV Pre-F重组蛋白，所述的氨基酸突变修饰为以下两种方式中的任意一种：
2.含有如权利要求1所述RSV重组蛋白的疫苗，其特征在于，所述的疫苗是以RSV重组蛋白作为唯一免疫原的疫苗。
3.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于,所述RSV重组蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo：3所示。
4.含有如权利要求1所述RSV重组蛋白的肺炎球菌多糖-RSV重组蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的结合疫苗以RSV重组蛋白作为载体蛋白，包括肺炎球菌多糖和RSV重组蛋白两种免疫原，RSV重组蛋白具有免疫原性。
5.根据权利要求4所述的肺炎球菌多糖-RSV重组蛋白结合疫苗，其特征在于,所述RSV重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示，所述的肺炎球菌荚膜多糖选自24种血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F中的一种或多种。
6.根
7.根据权利要求4所述的肺炎球菌多糖-RSV重组蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的肺炎球菌荚膜多糖以共价键与RSV重组蛋白相连接。
8.根据权利要求4所述的肺炎球菌多糖-RSV重组蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的结合疫苗，其制剂形式为水剂或冻干剂。
9.根据权利要求4所述的肺炎球菌多糖-RSV重组蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的结合疫苗中含有佐剂。
10.根据权利要求9所述的肺炎球菌多糖-RSV重组蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的佐剂为CpG、QS21、磷酸铝、CpG与磷酸铝混合物、或QS21与磷酸铝混合物中的任意一种。
11.编码如权利要求1所述的RSV重组蛋白的核苷酸序列。
12.含有如权利要求11所述的核苷酸序列的重组表达载体。
13.利用如权利要求12所述的重组表达载体制备RSV重组蛋白的表达方法，其特征在于，所述的表达方法采用CHO细胞表达系统或昆虫杆状病毒表达系统。
14.如权利要求4-10任一项所述的肺炎球菌多糖-RSV重组蛋白结合疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述的肺炎球菌荚膜多糖和RSV重组蛋白是在缓冲液或有机溶剂中，通过化学合成反应得到的结合物。
15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂选自二甲基亚砜或二甲基甲酰胺。
16.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述化学合成反应选自还原胺法、1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate法，己二酰二肼法或1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐法中的一种。
17.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括肺炎球菌荚膜多糖的前处理、RSV重组蛋白的表达和纯化以及结合物的纯化。
18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述的多糖前处理包括降解和活化，所述的降解方法选自高压均质机降解、酸水解法或酶消化法。
...【技术特征摘要】
1.一种rsv重组蛋白，其特征在于，所述的rsv重组蛋白是经过氨基酸突变修饰稳定性增强的rsv pre-f重组蛋白，所述的氨基酸突变修饰为以下两种方式中的任意一种：
2.含有如权利要求1所述rsv重组蛋白的疫苗，其特征在于，所述的疫苗是以rsv重组蛋白作为唯一免疫原的疫苗。
3.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于,所述rsv重组蛋白的氨基酸序列如seq idno：3所示。
4.含有如权利要求1所述rsv重组蛋白的肺炎球菌多糖-rsv重组蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的结合疫苗以rsv重组蛋白作为载体蛋白，包括肺炎球菌多糖和rsv重组蛋白两种免疫原，rsv重组蛋白具有免疫原性。
5.根据权利要求4所述的肺炎球菌多糖-rsv重组蛋白结合疫苗，其特征在于,所述rsv重组蛋白的氨基酸序列如seq id no：3所示，所述的肺炎球菌荚膜多糖选自24种血清型1、2、3、4、5、6a、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f及33f中的一种或多种。
6.根据权利要求4所述的肺炎球菌多糖-rsv重组蛋白结合疫苗，其特征在于,所述结合疫苗为24价肺炎球菌多糖-rsv重组蛋白结合疫苗，其中rsv重组蛋白的氨基酸序列如seqid no：3所示，所述的肺炎球菌荚膜多糖包括24种血清型1、2、3、4、5、6a、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f及33f。
7.根据权利要求4所述的肺炎球菌多糖-rsv重组蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的肺炎球菌荚膜多糖以共价键与rsv重组蛋白相连接。
8.根据权利要求4所述的肺炎球菌多糖-rsv重组蛋...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵娜，刘苏艳，
申请(专利权)人：普大生物科技泰州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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