鸭源性冠状病毒Ｍ蛋白基因及其克隆方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种鸭源性冠状病毒Ｍ蛋白基因。其具有ＳＥＱ?ＩＤ?Ｎｏ．３、４所示的核苷酸序列和氨基酸序列；其克隆方法为：选取鸭源性冠状病毒ＺＺ２００４株，以５′－ＧＴＣＧＣＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＴＧＧＴＡ－３′为上游引物，以５′－ＡＴＡＣＧＣＴＴＣＣＧＴＧＣＴＣＴＴＡ－３′为下游引物；通过ＲＴ－ＰＣＲ的方法扩增出鸭源性冠状病毒膜蛋白基因全长片段，再与ｐＭＤ１８－Ｔ载体连接。与同类冠状病毒相比，ＺＺ２００４变异的程度较大，感染谱更广，对其膜蛋白基因结构研究，从分子生物学水平上揭示其流行、变异规律，对于研制开发有效基因工程亚单位蛋白疫苗及防治ＩＢ的药物，进而预防和控制ＩＢ的发生与流行有着重要的意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种鸭源性冠状病毒M蛋白基因及其克隆方法与应用。
技术介绍
1937年，冠状病毒(Coronaviruses)首先从鸡身上分离出来。1965年，分离出第一株人的冠状病毒。由于在电子显微镜下可观察到其外膜上有明显的棒状粒子突起，使其形态看上去像中世纪欧洲帝王的皇冠，因此命名为“冠状病毒”。根据病毒的血清学特点和核苷酸序列的差异，目前冠状病毒科分为冠状病毒和环曲病毒两个属。冠状病毒科的代表株为禽传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus，IBV)。该病毒为有囊膜、呈中等多形性球状或椭圆形的病毒粒子，表面有杆状突起。禽传染性支气管炎(IB)是由冠状病毒科的禽传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种常见多发的急性高度接触性传染病，表现为呼吸型、肾型、肠型、腺胃型等多种病型。该病可感染所有日龄的鸡，导致生长迟缓、死亡、增重和饲料报酬降低。IBV往往引起复合感染，如新城疫(Newcastle Disease，ND)、慢性呼吸道病(CRD)等，并可继发细菌性疾病，如大肠杆菌病、沙门氏菌病等，从而加重了对鸡群的危害。据《世界家禽》1999年资料，全世界的禽病中，以呼吸系统疾病最为严重，其中IB是世界大多数地区危害养鸡业的主要疾病。1988年以来，IB在我国大部分地区相继流行，疫区的发病率可达100％，死亡率可达10～30％。国内外已报道的IBV有26种以上血清型，因血清型及新变型众多，不同血清型之间缺乏交叉保护，新的变异株不断出现和流行，是造成鸡群免疫失败的原因。这使得IB对养鸡业造成的威胁持续存在。而掌握流行毒株的生物学特性和流行特点是正确使用疫苗的前提。2004年5月，河南省郑州某养殖场发生了以腹泻和生长迟缓为主要症状的疑似IB疾病，感染鸡主要表现精神沉郁，下痢，生长缓慢及抵抗力下降，发病率为100％，死亡率达20％以上，感染鸡群的生产性能显著降低。调查中显示，与鸡舍相距仅150米左右处有一个1700只的肉鸭群，在第一批鸡发病前约10天左右鸭群发生过类似症状的疾病，但没有造成大量死亡。死亡鸡病变主要为小肠出血，肠壁变薄，有的有溃荡，小肠绒毛脱落，腺胃乳头肿大、粘膜脱落，有的肌胃和腺胃交界处有出血，肌胃有出血或溃荡，肾脏肿大，呈“花斑肾”，肺脏无明显变化，法氏囊、胸腺等免疫器官萎缩；病鸭剖检以肾脏肿大，苍白兼有出血、腿肌及肝脏出血为主要特征。在同地区的其他鸡场也发生了同样症状的疾病，虽然经过多种IBV疫苗的免疫但疫情未得到有效控制。河南科技学院动物科学学院开展了对该疫病的研究工作，结果从发病鸭体内分离到一株病毒，鉴定为IBV，命名为鸭源性冠状病毒ZZ2004株，保藏编号为CGMCC NO.3842，其专利申请号为201010225577.4，此为第一次有关家鸭感染IBV的报道。IBV粒子含有3种特异性蛋白，即核衣壳蛋白(N)，膜蛋白(M)和纤突蛋白(S)；S蛋白位于病毒粒子表面，由等摩尔的S1和S2两个亚单位组成，S蛋白上有主要的病毒保护-->性抗原表位，其中的S1部分可激发中和抗体、凝血抗体，与病毒的组织嗜性有关，同时也是IBV基因组中变异最大的部分，所以国内的研究长期以来多集中在S1基因上，而对占病毒总量40％的M蛋白的研究很少。M蛋白膜外部分的亲水端含有多个糖基化位点，对病毒的传染性具有决定性的作用，其与病毒的复制、抗感染、诱导白细胞产生a-干扰素等相关，M蛋白基因是保守性较高的基因。当前，人们对IBV M蛋白基因的研究尚处于探索阶段。因此，当前迫切需要深入系统的研究IBV中的M蛋白基因，进而从分子生物学水平上揭示IBV的流行和变异规律，对于研制开发有效基因工程亚单位蛋白疫苗及防治IB的药物，进而预防和控制IB的发生与流行有着重要的意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是分离出了一种鸭源性冠状病毒ZZ2004，对其M蛋白基因进行了分析测序，给出了一种克隆该M蛋白基因的方法，并指出了其用途。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种鸭源性冠状病毒(ZZ2004，其保藏编号为CGMCC N0.3842)的M蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。一种鸭源性冠状病毒(ZZ2004，其保藏编号为CGMCC NO.3842)的M蛋白基因，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。上述鸭源性冠状病毒的M蛋白基因的克隆方法，包括以下步骤：(1)选取鸭源性冠状病毒ZZ2004株，以5′-GTCGCTAGAGGAGAATGGTA-3′为上游引物，以5′-ATACGCTTCCGTGCTCTTA-3′为下游引物；(2)通过RT-PCR的方法扩增出鸭源性冠状病毒ZZ2004株膜蛋白基因全长片段，PCR的扩增条件94℃，5min；94℃1min，53℃1min，72℃1min，共35个循环，最后于72℃延伸10min，4℃结束反应；(3)然后将膜蛋白基因全长片段与pMD18-T载体连接。上述鸭源性冠状病毒的M蛋白基因在制备IBV基因工程亚单位蛋白疫苗中的应用，该M蛋白基因可被克隆到质粒载体或真核表达载体上进一步研制出IBV核酸疫苗及活载体疫苗对预防IBV将具有重要意义。上述鸭源性冠状病毒的M蛋白基因在制备防治鸡传染性支气管炎药物中的应用，该M蛋白基因一旦被导入植物，并在植物中表达出活性蛋白，有望研制出转基因植物可食疫苗，作为禽类饲料添加剂，家禽食用含有该种抗原的转基因植物，将激发肠道免疫系统，从而产生对IBV的免疫能力。上述鸭源性冠状病毒(Avian infectious bronchitis virus，IBV)ZZ2004，已于2010年4月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，该鸭源性冠状病毒的保藏编号为CGMCC NO.3842，其中国专利申请号为201010225577.4。本专利技术具有积极有益的效果：此前尚无有关家鸭感染IBV的报道，本病毒分离株ZZ2004来自鸡鸭混养的养殖场，本病毒不仅可以引起鸡的大批发病及死亡，还可严重影响家鸭的生长发育，同时引起鸭的感染和死亡。与其它禽类的冠状病毒相比，ZZ2004变异的程度较大，对动物的感染谱更-->广，开展对本病毒株的膜蛋白基因结构研究，对于揭示IBV变异规律，区分不同的血清型，研制新型IBM疫苗和/或抗IB药物，进而对有效的防控IB起到重要作用。附图说明图1为鸭源性冠状病毒ZZ2004的M基因推导的氨基酸序列同源性比对图谱；图2为鸭源性冠状病毒ZZ2004分离株与参考毒株的M蛋白系统进化树；图3为鸭源性冠状病毒ZZ2004的M基因的扩增结果。具体实施方式以下结合具体实施例进一步阐述本专利技术，但本专利技术的保护内容并不局限于下述具体实施例。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特别说明，均购自常规生化试剂商店。实施例1鸭源性冠状病毒ZZ2004的M基因的克隆方法(1)PCR引物设计设计如下引物序列：上游引物5′-gtcgctagaggagaatggta-3′；下游引物5′-atacgcttccgtgctctta-3′。(2)ZZ2004本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸭源性冠状病毒的Ｍ蛋白基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．３所示。

【技术特征摘要】
1.一种鸭源性冠状病毒的M蛋白基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。2.一种鸭源性冠状病毒的M蛋白基因，其特征在于，该基因的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。3.权利要求1或2所述鸭源性冠状病毒的M蛋白基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)选取鸭源性冠状病毒ZZ2004株，以5′-GTCGCTAGAGGAGAATGGTA-3′为上游引物，以5′-ATACGCTTCCGTGCTCTTA-3′为下游引物；(2...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚四新，刘兴友，赵淑秋，刘金华，李学斌，王丽荣，王宪文，王自良，赵坤，张兆沛，
申请(专利权)人：河南科技学院，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]