【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物传感，特别是涉及一种光激活dna四面体限域催化发夹组装纳米器件及其制备方法和应用。
技术介绍
1、无酶核酸扩增技术为活细胞中低丰度mirna成像提供了有效的平台。其中，催化发夹自组装(cha)和杂交链反应(hcr)是常见的无酶核酸扩增技术，均是通过链置换来实现信号放大。但是，这些hcr回路需要消耗细胞内靶rna进行信号放大，这可能会干扰活细胞或器官的正常功能。而cha是由两个部分互补的dna发夹和一个引发链(靶mirna)组成，并依赖由引发链(靶mirna)触发两个dna发夹形成杂交双链体，进而释放靶mirna的过程。该双链体的形成不是消耗而是重新释放靶mirna以重复触发下一个反应，从而实现靶mirna的循环，因此cha被广泛应用于分析领域。尽管cha技术检测灵敏，但仍然存在一些缺陷，例如，dna发夹纳米器件不能自由地穿越质膜进入活细胞，通常需要转染试剂或纳米材料辅助才能进入细胞；其次，cha的动力学取决于游离dna发夹的扩散速率及浓度；第三，单独的dna发夹纳米器件生物稳定性差，容易被核酸酶降解。因此，迫切需要开发一个细胞渗透性和稳定性均良好的cha系统，并且要求提高动力学和准确度等性能，以为活细胞中低丰度mirna成像提供更加的生物平台。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种光激活dna四面体限域催化发夹组装纳米器件及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，该纳米器件可用于活细胞中mirna成像分析，为mirna相关的生物医学研究提供了一种重
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供一种光激活dna四面体限域催化发夹组装纳米器件，所述纳米器件包括dna四面体、用于mirna-21测定的发夹探针对h1和h2、以及用于mirna-155测定的发夹探针对h3和h4；其中，所述dna四面体的四个顶点分别具有一条手臂链，所述h1、h2、h3和h4通过碱基互补配对分别与四条所述手臂链连接。
4、优选的是，所述dna四面体是由t1、t2、t3和t4四条寡核苷酸链自组装而成，所述t1、t2、t3和t4四条寡核苷酸链的序列分别如seq id no：1-4所示。
5、优选的是，所述h1、h2、h3和h4的核苷酸序列分别如seq id no：5-8所示。
6、优选的是，所述h2和所述h4的5’端修饰猝灭基团，中间部分修饰荧光基团，所述h1和所述h3的5’端第8碱基与第9个碱基间嵌入光裂解基团。
7、优选的是，所述猝灭基团包括bhq1和bhq2，所述荧光基团包括fam和cy3，所述光裂解基团包括pc-linker。
8、本专利技术还提供一种所述的光激活dna四面体限域催化发夹组装纳米器件的制备方法，包括以下步骤：
9、将t1、t2、t3和t4四条寡核苷酸链在te缓冲液中退火自组装形成dna四面体；
10、将用于mirna-21测定的发夹探针对h1和h2、以及用于mirna-155测定的发夹探针对h3和h4在te缓冲液中进行淬火，形成发夹纳米器件；
11、将所述dna四面体和所述发夹纳米器件杂交反应，制得所述光激活dna四面体限域催化发夹组装纳米器件。
12、优选的是，所述退火的条件为：95℃5min，自然冷却至室温；
13、所述淬火的条件为：95℃5min，迅速转至冰浴5min；
14、所述杂交的条件为：37℃水浴中杂交反应4h。
15、本专利技术还提供所述的光激活dna四面体限域催化发夹组装纳米器件在制备监测活细胞中mirna表达水平的产品中的应用。
16、优选的是，所述mirnas包括mirna-21和mirna-155。
17、优选的是，所述mirna-21的核苷酸序列如seq id no：9所示，所述mirna-155的核苷酸序列如seq id no：10所示。
18、本专利技术公开了以下技术效果：
19、(1)本专利技术提供的dna四面体由于具有序列设计简单、组装快速、细胞穿透性好等优点，被广泛用于监测细胞内低丰度生物分子。
20、(2)本专利技术将两对dna发夹纳米器件组装到dna四面体结构上，限制dna发夹纳米器件的空间位置，增加其局部浓度从而提高cha反应的动力学效率；并利用dna纳米结构优势，提高dna发夹纳米器件的细胞穿透性和稳定性。
21、(3)本专利技术通过将两对dna发夹探针对组装到dna四面体结构上可以实现多种mirnas的同时成像，对研究mirna的功能及相关生物医学应用具有重要意义。
22、(4)本专利技术在发夹茎部引入光敏感基团(pc-linker)用于细胞内mirnas的可控识别成像，降低纳米器件运输过程中在非特定位置和非特定时间的干扰响应，提高分析的准确度。
23、(5)本专利技术构建了一种光激活的dna四面体限域催化发夹自组装纳米器件，用于活细胞中两种mirna可控荧光成像的同时，还可用于不同细胞中mirna表达水平的监测。因此，所构建的纳米器件在mirna相关的疾病诊断及其生物医学研究中具有重要价值。
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1.一种光激活DNA四面体限域催化发夹组装纳米器件，其特征在于，所述纳米器件包括DNA四面体、用于miRNA-21测定的发夹探针对H1和H2、以及用于miRNA-155测定的发夹探针对H3和H4；其中，所述DNA四面体的四个顶点分别具有一条手臂链，所述H1、H2、H3和H4通过碱基互补配对分别与四条所述手臂链连接。
2.如权利要求1所述的光激活DNA四面体限域催化发夹组装纳米器件，其特征在于，所述DNA四面体是由T1、T2、T3和T4四条寡核苷酸链自组装而成，所述T1、T2、T3和T4四条寡核苷酸链的序列分别如SEQ ID NO：1-4所示。
3.如权利要求1所述的光激活DNA四面体限域催化发夹组装纳米器件，其特征在于，所述H1、H2、H3和H4的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5-8所示。
4.如权利要求1所述的光激活DNA四面体限域催化发夹组装纳米器件，其特征在于，所述H2和所述H4的5’端修饰猝灭基团，中间部分修饰荧光基团，所述H1和所述H3的5’端第8碱基与第9个碱基间嵌入光裂解基团。
5.如权利要求4所述的光激活DNA
6.一种如权利要求1-5任一项所述的光激活DNA四面体限域催化发夹组装纳米器件的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述退火的条件为：95℃5min，自然冷却至室温；
8.如权利要求1-5任一项所述的光激活DNA四面体限域催化发夹组装纳米器件在制备监测活细胞中miRNA表达水平的产品中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述miRNAs包括miRNA-21和miRNA-155。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述miRNA-21的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述miRNA-155的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
...【技术特征摘要】
1.一种光激活dna四面体限域催化发夹组装纳米器件，其特征在于，所述纳米器件包括dna四面体、用于mirna-21测定的发夹探针对h1和h2、以及用于mirna-155测定的发夹探针对h3和h4；其中，所述dna四面体的四个顶点分别具有一条手臂链，所述h1、h2、h3和h4通过碱基互补配对分别与四条所述手臂链连接。
2.如权利要求1所述的光激活dna四面体限域催化发夹组装纳米器件，其特征在于，所述dna四面体是由t1、t2、t3和t4四条寡核苷酸链自组装而成，所述t1、t2、t3和t4四条寡核苷酸链的序列分别如seq id no：1-4所示。
3.如权利要求1所述的光激活dna四面体限域催化发夹组装纳米器件，其特征在于，所述h1、h2、h3和h4的核苷酸序列分别如seq id no：5-8所示。
4.如权利要求1所述的光激活dna四面体限域催化发夹组装纳米器件，其特征在于，所述h2和所述h4的5’端修饰猝灭基团，中间部分修饰荧光基团，所述h1和所述h3的5’端第...
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