【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物传感器，具体涉及一种用于检测硝基还原酶的生物传感器及其制备方法以及硝基还原酶的定量检测方法。
技术介绍
1、硝基还原酶(ntr)是一种含黄素酶家族，在还原烟酰胺腺苷核苷酸(nadh)的存在下能够降低含硝基化合物的含量。此外，硝基还原酶也被报道在癌症治疗中基于硝基化合物的前药的激活中发挥作用。因此，对癌细胞中硝基还原酶的敏感和选择性检测和成像对于更好地了解其生物学功能或开发癌症治疗探针具有重要意义。
2、对硝基还原酶检测的研究，目前已经有很多方法，其中荧光探针能够对组织中异常表达的分子进行敏感和高灵敏度的成像，是分子生物学和癌症治疗的关键工具。但是，这些荧光探针多数是游离的有机小分子染料，其存在代谢过快，对于正常组织与肿瘤部位信号对比度较弱等局限性。
3、因此，癌细胞中硝基还原酶的敏感和选择性检测和成像对于更深入地了解其生物学功能或开发更好的癌症治疗探针具有重要意义。能够实现对癌细胞中硝基还原酶简便、灵敏度和选择性高的定量检测是当下需要解决的问题。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种用于检测硝基还原酶的生物传感器及其制备方法及应用，所述生物传感器为基于金属离子-氨基酸协调驱动的多刺激响应近红外荧光的生物传感器，只需要经过简单的一步自组装就能合成；其可用于实现硝基还原酶的定量检测。
2、本专利技术还提供了一种硝基还原酶的定量检测方法，以本专利技术提供的生物传感器为传感器，可实现硝基还原酶的定量检测，在检测时通
3、为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：
4、一种用于检测硝基还原酶的生物传感器的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
5、将cy-no2的乙醇溶液、fmoc-h的盐酸溶液混合均匀，然后加入zn2+水溶液，搅拌均匀后调节体系的ph至7，继续搅拌反应55～65min，然后经离心、洗涤、干燥，即可制备得到用于检测硝基还原酶的生物传感器zfc nps。
6、所述fmoc-h、cy-no2的分子结构分别如下：
7、fmoc-h：c21h19n3o4
8、
9、cy-no2：c48h58n5o4
10、
11、反应体系中，cy-no2、fmoc-h与zn2+的摩尔比为1:2:1。
12、cy-no2的乙醇溶液、fmoc-h的盐酸溶液、zn2+水溶液的摩尔浓度相同。
13、所述干燥为冷冻干燥。
14、本专利技术还提供了所述制备方法制备得到的用于检测硝基还原酶的生物传感器，此荧光传感器在没有硝基还原酶的反应体系中基本无荧光，加入硝基还原酶后，并在ph6.5的反应体系下，在680nm激发波长下，可发出强烈的荧光。
15、本专利技术还提供了所述用于检测硝基还原酶的生物传感器在检测硝基还原酶中的应用。
16、本专利技术还提供了一种硝基还原酶的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
17、1)将多组zfc nps分别分散在ph＝6.5pbs缓冲溶液中，然后加入系列浓度的硝基还原酶溶液，避光反应1h；
18、2)测试各反应体系在680nm激发波长下的荧光光谱；
19、3)以硝基还原酶溶液的浓度为横坐标，785nm处荧光强度为纵坐标构建线性曲线，进而得出线性方程，根据线性方程即可得到任意785nm处荧光强度所对应的待测硝基还原酶的浓度。
20、步骤1)中，硝基还原酶溶液的浓度分别为10μg/ml、5μg/ml、1.5μg/ml、1.2μg/ml、0.8μg/ml、0.6μg/ml、0.4μg/ml、0.25μg/ml、0μg/ml。
21、步骤3)中，所述线性方程为y＝1050.16x-10.5763，其中，y为785nm处荧光强度，x为硝基还原酶浓度，其线性相关系数为0.994。
22、本专利技术提供的用于检测硝基还原酶的生物传感器的制备方法中，通过使用金属结合氨基酸、金属离子和cy-no2作为构建块，在配位和多种非共价相互作用的基础上获得了均匀的zfc nps纳米试剂。
23、本专利技术中选择具有良好生物相容性的9-芴基甲基氧羰基修饰组氨酸(fmoc-h)作为桥接配体，锌离子(zn2+)作为正常生理过程所需的微量元素，很容易被代谢和清除，没有明显的副作用，cy-no2对缺氧细胞中过表达的ntr表现出敏感和选择性，纳米试剂具有高负载能力，并在肿瘤微环境中显示出响应性释放特性，应用zfc nps纳米试剂通过体外荧光生物成像技术可用于监测缺氧细胞ntr。
24、本专利技术提供的生物传感器可用于ntr浓度的定量检测，检测的反应液需要在ph6.5的酸性环境中进行，从而保证荧光探针的有效释放，生物传感器中fmoc-h上的咪唑基团在酸性溶液中会质子化，从而会释放出具有高荧光强度的cy-no2。cy-no2由荧光报告单元(氨基酰胺染料)和ntr识别单元(对硝基苄基氨基甲酸酯)组成。生物传感器中由吸电子基团诱导的电子转移过程猝灭了其荧光发射，只要生物传感器中的硝基被ntr催化成功还原为氨基，荧光信号就会从关闭到开启。如果不在酸性中进行，加入ntr后荧光强度并无太大变化，这样导致的结果是这种荧光强度无法建立起与ntr浓度的对应关系，进而无法实现对于ntr浓度的定量检测。
25、ntr浓度的定量检测时，随着硝基还原酶浓度的增大，检测体系的荧光信号逐渐增强，以硝基还原酶溶液的浓度为横坐标，检测体系在特定发射波长下的荧光强度为纵坐标构即可建出线性曲线，来实现对于硝基还原酶的定量检测，其检测方法的操作简单，灵敏度高。
26、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
27、本专利技术提供的用于检测硝基还原酶的生物传感器的制备方法简单，经简单的一步自组装即可制备得到，其可用于硝基还原酶的定量检测，并可通过体外荧光生物成像技术用于监测缺氧癌症细胞ntr，具体很好的应用前景。
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1.一种用于检测硝基还原酶的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，反应体系中，Cy-NO2、Fmoc-H与Zn2+的摩尔比为1:2:1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，Cy-NO2的乙醇溶液、Fmoc-H的盐酸溶液、Zn2+水溶液的摩尔浓度相同。
4.如权利要求1-3任意一项所述的制备方法制备得到的用于检测硝基还原酶的生物传感器。
5.如权利要求4所述的用于检测硝基还原酶的生物传感器在检测硝基还原酶中的应用。
6.一种硝基还原酶的定量检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的硝基还原酶的定量检测方法，其特征在于，步骤1)中，硝基还原酶溶液的浓度分别为10μg/mL、5μg/mL、1.5μg/mL、1.2μg/mL、0.8μg/mL、0.6μg/mL、0.4μg/mL、0.25μg/mL、0μg/mL。
8.根据权利要求6所述的硝基还原酶的定量检测方法，其特征在于，步骤3)中，所述线
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测硝基还原酶的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，反应体系中，cy-no2、fmoc-h与zn2+的摩尔比为1:2:1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，cy-no2的乙醇溶液、fmoc-h的盐酸溶液、zn2+水溶液的摩尔浓度相同。
4.如权利要求1-3任意一项所述的制备方法制备得到的用于检测硝基还原酶的生物传感器。
5.如权利要求4所述的用于检测硝基还原酶的生物传感器在检测硝基还原酶中的应用。
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