【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞保存试剂应用，具体涉及一种l-脯氨酸在提高玻璃化冷冻生发泡期卵母细胞冻后发育率中的应用。
技术介绍
1、现有地方猪品种资源十分丰富，是生物遗传多样性研究的重要基础。但随着现代集约化畜牧业的发展，一些优良地方猪种群数量急剧减少，如何有效保护和合理利用这些宝贵的遗传资源给地方猪种的发展带来了严峻挑战。传统的活体保种方式抵御疾病和自然灾害能力较弱，并且需要大量的资金和劳动力投入。而随着低温生物学的不断发展，冷冻保存技术为动物遗传资源保存提供了新的途径。
2、卵母细胞冷冻保存技术是胚胎生物工程的重要组成部分。通过冷冻保存卵母细胞，可以建立雌性动物基因库，不仅为体外受精、核移植等胚胎生物技术的研究提供丰富的卵母细胞资源，也可用于优良畜禽品种和濒危珍稀物种遗传资源的长期保存。2014年，somfai等首次采用玻璃化冷冻法成功保存猪生发泡(germinal vesicle，gv)期卵母细胞并获得活仔猪(somfai et al.2014)。近年来，猪卵母细胞的冷冻损伤机理不断被阐明，冷冻保存体系逐步被优化，有效提高了猪卵母细胞解冻后发育及复原能力。但与牛、羊等反刍动物相比，猪卵母细胞的脂质含量更加丰富，对低温耐受性更差(mcevoy et al.2000)，冷冻保存效率依然很低。
3、卵母细胞玻璃化冷冻是指将卵母细胞在含高浓度冷冻保护剂(cryoprotectiveagents，cpas)的溶液中短暂处理后，在0℃以上温度直接投入液氮中进行冷冻保存的一种超速冷冻方式。cpas主要由渗透性cpas、非渗
4、自然界中存在众多的天然渗透调节物质，对维持细胞渗透平衡起着重要作用。在低温胁迫下，一些渗透调节物质会大量生成，如氨基酸、多元醇、可溶性糖等。脯氨酸(proline)是一种带有氨基的非极性环状吡咯烷侧链的天然氨基酸，具有分子量小、水溶性大等特点(hayat et al.2012)，其独特的环状结构特征决定了它可以与一侧的水分子和另一侧的大分子相互作用，通过渗透进细胞，平衡膨压并缓解水分胁迫(etal.2016)。大量研究表明，脯氨酸积累是植物对抗胁迫应激的一种重要的代谢适应性机制(khalid et al.2022)。脯氨酸在提高植物抗逆性、制药工业、药物治疗和再生医学方面均显示出巨大的应用前景和开发潜质(patriarca et al.2021)。目前，有关脯氨酸的专利多集中在其提取制备、生产加工、疾病防治以及药物开发应用等方面，例如，一种dl-脯氨酸的制备方法(cn111836800b)，一种提纯脯氨酸的方法(cn101348453b)，一种生产l-脯氨酸的方法(cn108841886b)，一种d-脯氨酸的合成方法(cn107827802b)，一种功能性氨基酸脯氨酸的制备方法(cn101830842b)，一种脯氨酸基聚合物的合成方法(cn113501946b)，基于羟脯氨酸的聚合物及其制备方法和解聚方法(cn111621014b)，一种含有羟脯氨酸的化合物及其制备方法和应用(cn109761957b)，一种冷却结晶精制l-脯氨酸的方法(cn103265467b)，脯氨酸和丙氨酸在防治小麦赤霉病中的应用(cn113854302b)，利用l-脯氨酸诱导培养提高酵母抑制果实病害效力的方法、制剂及所用培养基(cn109628334b)，脯氨酸在香菇高温栽培中的应用(cn111418443b)，脯氨酸在蜜蜂病毒感染防治中的应用(cn111481541b)，一种利用外源脯氨酸提高早熟禾抗盐性的方法(cn103270894b)，脯氨酸在制备肺癌治疗药物中的应用(cn114028388a)，脯氨酸衍生物及其在制备治疗心脑血管疾病药物中的应用(cn110357800b)，l-脯氨酸在提高卵母细胞早期胚胎发育及抗氧化能力中的应用(cn110205284b)等。但关于脯氨酸在卵母细胞玻璃化冷冻中的应用迄今未见相关报道。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种l-脯氨酸在提高玻璃化冷冻生发泡期卵母细胞冻后发育率中的应用，该应用可提高解冻后卵母细胞孤雌激活胚胎发育率。
2、为实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案为：
3、l-脯氨酸在提高玻璃化冷冻生发泡期卵母细胞冻后发育率中的应用。
4、一种卵母细胞玻璃化冷冻液，其包括终浓度为1×tcm199，20％的fbs(胎牛血清)，10％ eg(乙二醇)，7.5％的dmso(二甲基亚砜)，0.4m的蔗糖和0.4～1m的l-脯氨酸。
5、一种提高玻璃化解冻后卵母细胞成熟和发育能力的前处理方法，其包括将卵母细胞置于冷冻平衡液中平衡后，移入含有l-脯氨酸的玻璃化冷冻液中处理30s，置于液氮中保存。
6、如上所述的前处理方法，优选地，所述冷冻平衡液为终浓度为1×tcm199，20％的fbs，7.5％的eg和7.5％的dmso；进一步地，所述玻璃化冷冻液为终浓度为1×tcm199，20％的fbs，10％ eg，7.5％的dmso，0.4m的蔗糖和0.4～1m的l-脯氨酸。如上所述的前处理方法，优选地，所述卵母细胞为生发泡阶段的猪卵母细胞。
7、本专利技术的有益效果在于：
8、本专利技术提供了l-脯氨酸在提高玻璃化冷冻生发泡期卵母细胞冻后发育率中的应用，还提供了l-脯氨酸在制备卵母细胞玻璃化冷冻制剂中的应用，该应用可提高解冻后卵母细胞孤雌激活胚胎发育率。
9、(1)本专利技术首次在猪卵母细胞玻璃化冷冻液中添加l-脯氨酸，促进了冷冻-解冻后卵母细胞存活、体外成熟和体外发育能力，提供了l-脯氨酸的一种新用途。
10、(2)本专利技术还提供了提高解冻后玻璃化卵母细胞成熟和发育能力的前处理方法，采用含l-脯氨酸的玻璃化冷冻液处理，其中l-脯氨酸是一种天然的渗透调节物质，能够显著缓解卵母细胞的渗透损伤，显著提高了解冻后卵母细胞的成熟和发育能力。
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1.L-脯氨酸在提高玻璃化冷冻生发泡期卵母细胞冻后发育率中的应用。
2.一种卵母细胞玻璃化冷冻液，其特征在于，其包括终浓度为1×TCM199，20％的FBS，10％EG，7.5％的DMSO，0.4M的蔗糖和0.4～1M的L-脯氨酸。
3.一种提高玻璃化解冻卵母细胞成熟和发育能力的前处理方法，其特征在于，其包括将卵母细胞置于冷冻平衡液中平衡后，移入含有L-脯氨酸的玻璃化冷冻液中处理30s，置于液氮中保存。
4.根据权利要求3所述的前处理方法，其特征在于，所述冷冻平衡液为终浓度为1×TCM199，20％的FBS，7.5％的EG和7.5％的DMSO。
5.根据权利要求3所述的前处理方法，其特征在于，所述玻璃化冷冻液为终浓度为1×TCM199，20％的FBS，10％EG，7.5％的DMSO，0.4M的蔗糖和0.4～1M的L-脯氨酸。
6.根据权利要求3所述的前处理方法，其特征在于，所述卵母细胞为生发泡阶段的猪卵母细胞。
【技术特征摘要】
1.l-脯氨酸在提高玻璃化冷冻生发泡期卵母细胞冻后发育率中的应用。
2.一种卵母细胞玻璃化冷冻液，其特征在于，其包括终浓度为1×tcm199，20％的fbs，10％eg，7.5％的dmso，0.4m的蔗糖和0.4～1m的l-脯氨酸。
3.一种提高玻璃化解冻卵母细胞成熟和发育能力的前处理方法，其特征在于，其包括将卵母细胞置于冷冻平衡液中平衡后，移入含有l-脯氨酸的玻璃化冷冻液中处理30s，置于液氮中保存。
【专利技术属性】
技术研发人员：庞云渭，孙雅雯，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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