本发明专利技术属于药物分析化学技术领域，具体涉及一种高效液相色谱法分离并检测克霉唑中间体中杂质a的方法。克霉唑中间体具体指邻氯苯基‑二苯基‑氯甲烷，杂质a为二苯基‑(2‑氯苯基)甲醇。该高效液相色谱法包括：采用衍生试剂处理待测样品，得到样品溶液；以十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱固定相，采用水作为流动相A，甲醇作为流动相B，通过线性梯度洗脱将杂质a和克霉唑中间体的衍生物进行分离；然后进入检测器进行检测；根据色谱结果，采用外标法对杂质a进行定性和定量。本发明专利技术方法专属性强、耐用性好、检测限低，对邻氯苯基‑二苯基‑氯甲烷及克霉唑产品的质量控制具有重要意义。
1、克霉唑是一种高效、价廉的广谱抗真菌药物，对白色念珠菌、红色毛癣菌、石膏样毛癣菌、新型隐球菌、曲菌、藻菌等具有显著抑制作用。邻氯苯基-二苯基-氯甲烷，为合成克霉唑的关键中间体，其合成路线主要由两条，一是以邻氯三氯甲苯为原料，在苯中经无水三氯化铝催化发生傅克反应，再与氯化亚砜进行氯代反应制得；二是由二苯基-(2-氯苯基)甲醇和二甲亚砜在通入氯气条件下，90℃回流5小时反应生成。邻氯苯基-二苯基-氯甲烷极易水解，如果保存条件不当会生成二苯基-(2-氯苯基)甲醇，即药典杂质ⅰ，该杂质在usp、ep、jp、bp中均有记载。药典规定在克霉唑中必须将此杂质限度控制在0.3％以下，相关制剂必须将其限度控制在1.0％以下，由此可见在本品中对杂质二苯基-(2-氯苯基)甲醇的控制是非常重要的，这关系到终产物克霉唑是否合格。
2、邻氯苯基-二苯基-氯甲烷，英文化学名为1-chloro-2-(chlorodiphenylmethyl)benzene，分子式为c19h14cl2，分子量为313.22，cas号为42074-68-0，结构式如式ⅰ所示。二苯基-(2-氯苯基)甲醇(杂质a)的结构式如式ⅱ所示。
4、目前暂未检索到有关邻氯苯基-二苯基-氯甲烷中二苯基-(2-氯苯基)甲醇的分析方法，因此，亟需寻找一种新的方法对邻氯苯基-二苯基-氯甲烷中的二苯基-(2-氯苯基)甲醇进行检测和控制。
>技术实现思路1、有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种利用柱前衍生化法分离克霉唑中间体中杂质a的方法，该方法可在30分钟内或大于30分钟的时间实现克霉唑中间体中杂质a的分离，具有专属性强、耐用性好，分析时间短的特点。
2、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、利用柱前衍生化法分离克霉唑中间体中杂质a的方法，所述克霉唑中间体为邻氯苯基-二苯基-氯甲烷，其结构式如式ⅰ所示；所述杂质a为二苯基-(2-氯苯基)甲醇，其结构式如式ⅱ所示；所述柱前衍生化法包括：采用衍生试剂处理待测样品，得到样品溶液；以十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱固定相，采用流动相a和流动相b作为流动相，所述流动相a为水，所述流动相b为甲醇；通过梯度洗脱将所述杂质a和所述克霉唑中间体的衍生物进行分离；
4、
5、本专利技术研究发现，若直接进液相系统，杂质a与本品邻氯苯基-二苯基-氯甲烷会在同一位置出峰，且药典相关方法只适用于克霉唑中对此杂质的检测，不适用于本品。所以本专利技术采用苯胺衍生的方法对本品进行柱前衍生，使本品(衍生物)与二苯基-(2-氯苯基)甲醇进行有效分离。本专利技术方法对克霉唑的合成及质量控制具有重要的意义。
6、进一步，所述衍生试剂为苯胺和乙腈的混合溶液，其中苯胺和乙腈的体积比为1：1。
7、进一步，衍生处理的温度为40-60℃，优选为50℃。
8、进一步，所述梯度洗脱程序如下：
9、在0分钟，设置所述流动相a和所述流动相b的体积比为25-40：60-75；
10、在2分钟，设置所述流动相a和所述流动相b的体积比为25-40：60-75；
11、在20分钟，设置所述流动相a和所述流动相b的体积比为10-20：80-90；
12、在21分钟，设置所述流动相a和所述流动相b的体积比为25-40：60-75；
13、在30分钟，设置所述流动相a和所述流动相b的体积比为25-40：60-75。
14、作为优选，所述梯度洗脱程序如下：
15、在0分钟，设置所述流动相a和所述流动相b的体积比为28-32：68-72；
16、在2分钟，设置所述流动相a和所述流动相b的体积比为28-32：68-72；
17、在20分钟，设置所述流动相a和所述流动相b的体积比为10：90；
18、在21分钟，设置所述流动相a和所述流动相b的体积比为28-32：68-72；
19、在30分钟，设置所述流动相a和所述流动相b的体积比为28-32：68-72。
20、作为最优选，所述梯度洗脱程序如下：
21、在0分钟，设置所述流动相a和所述流动相b的体积比为30：70；
22、在2分钟，设置所述流动相a和所述流动相b的体积比为30：70；
23、在20分钟，设置所述流动相a和所述流动相b的体积比为10：90；
24、在21分钟，设置所述流动相a和所述流动相b的体积比为30：70；
25、在30分钟，设置所述流动相a和所述流动相b的体积比为30：70。
26、进一步，柱流速为0.8-1.5ml/min，优选为0.9-1.1ml/min，更优选为1.0ml/min；柱温为15-25℃，优选为18-22℃，更优选为20℃。
27、作为优选，色谱柱采用gl sciences ax-c18；色谱柱规格为4.6mm×250mm，5μm。
28、作为优选，进样体积为10μl。
29、本专利技术的目的之二在于提供一种检测克霉唑中间体中是否含有杂质a的方法，该方法成功实现了霉唑中间体中杂质a的定性检测，且检测限低至0.0904μg/ml，具有较高的灵敏度。
30、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
31、检测克霉唑中间体中是否含有杂质a的方法，利用前述方法将所述杂质a从所述克霉唑中间体中分离；并进入检测波长为225±5nm的检测器进行检测，得到色谱图；根据检测品与对照品的色谱行为的一致性来判断克霉唑中间体中是否含有杂质a。
32、作为优选，所述检测波长为225nm。
33、通过保留时间，可以对杂质a进行定性。
34、进一步，保留时间为11.9±0.5min，判定为所述杂质a；保留时间为19.8±0.5min，判定为所述克霉唑中间体的衍生物。
35、本专利技术的目的之三在于提供一种测定克霉唑中间体中杂质a含量的方法，该方法操作简单，重现性好，成功实现了克霉唑中间体中杂质a的定量检测。
36、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
37、测定克霉唑中间体中杂质a含量的方法，包括如下步骤：
38、(1)采用衍生试剂处理待测样品，并采用溶剂配制得到样品溶液和对照品溶液；
39、(2)利用权利要求6-8任一项所述的方法对样品溶液和对照品溶液进行检测，并得到色谱图；
40、(3)根据步骤(2)获得色谱图，采用外标法以峰面积计算杂质a的含量。
41、进一步，所述溶剂为乙腈水溶液，其中乙腈和水的体积比为95:5。
42、进一步，在0.3-30.1μg/ml浓度范围内，所述杂质a的线性方程为y＝0.424x+0.0053，r＝1.本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.利用柱前衍生化法分离克霉唑中间体中杂质a的方法，其特征在于，所述克霉唑中间体为邻氯苯基-二苯基-氯甲烷，其结构式如式Ⅰ所示；所述杂质a为二苯基-(2-氯苯基)甲醇，其结构式如式Ⅱ所示；所述柱前衍生化法包括：采用衍生试剂处理待测样品，得到样品溶液；以十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱固定相，采用流动相A和流动相B作为流动相，所述流动相A为水，所述流动相B为甲醇；通过梯度洗脱将所述杂质a和所述克霉唑中间体的衍生物进行分离；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述衍生试剂为苯胺和乙腈的混合溶液，其中苯胺和乙腈的体积比为1：1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，衍生处理的温度为40-60℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序如下：
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，柱流速为0.8-1.5ml/min；柱温为15-25℃。
6.检测克霉唑中间体中是否含有杂质a的方法，其特征在于，利用权利要求1-5任一项所述的方法将所述杂质a从所述克霉唑中间体中分离；并进入检测波长为225±5nm的检测器进行检测，得到色谱图；根据检测品与对照品的色谱行为的一致性来判断克霉唑中间体中是否含有杂质a。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，保留时间为11.9±0.5min，判定为所述杂质a；保留时间为19.8±0.5min，判定为所述克霉唑中间体的衍生物。
8.测定克霉唑中间体中杂质a含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述溶剂为乙腈水溶液，其中乙腈和水的体积比为95:5。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在0.3-30.1μg/ml浓度范围内，所述杂质a的线性方程为y＝0.424x+0.0053，r＝1.0000；其中，x为X轴，表示浓度，y为Y轴，表示峰面积。
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【技术特征摘要】
1.利用柱前衍生化法分离克霉唑中间体中杂质a的方法，其特征在于，所述克霉唑中间体为邻氯苯基-二苯基-氯甲烷，其结构式如式ⅰ所示；所述杂质a为二苯基-(2-氯苯基)甲醇，其结构式如式ⅱ所示；所述柱前衍生化法包括：采用衍生试剂处理待测样品，得到样品溶液；以十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱固定相，采用流动相a和流动相b作为流动相，所述流动相a为水，所述流动相b为甲醇；通过梯度洗脱将所述杂质a和所述克霉唑中间体的衍生物进行分离；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述衍生试剂为苯胺和乙腈的混合溶液，其中苯胺和乙腈的体积比为1：1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，衍生处理的温度为40-60℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序如下：
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，柱流速为0.8-1.5ml/min；柱温为15-25℃。
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【专利技术属性】
技术研发人员：魏麟苏，陈雯，周书荣，唐舒棠，刘阔，
申请(专利权)人：重庆华邦制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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