【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及dna检测方法和dna检测系统，特别是涉及数字pcr。
技术介绍
1、在以往的基因检查中，有pcr(专利文献2-4)或实时pcr(非专利文献1)等的方法。在这些方法中，成为检测对象的基因(在本说明书中，称为“目标基因”)为微量时，测定再现性降低。
2、作为解决该问题的方法，开发出了数字pcr(专利文献1)。如果使用数字pcr，则能够使用极限稀释后的样品，将dna以0(无)或1(有)进行判定、检测，从而对微量的dna进行定量。
3、以下表示使用数字pcr对检测体中的dna进行定量方法的一例。首先，从检测体制备pcr反应液时，将pcr反应液在板的孔中或者分割为油中的微滴(droplet)时，在各微小分组(aliquot)中，分别稀释检测体，使其成为加入了或者没有加入1分子的目标基因的任意一种状态，并加入pcr所需要的dna聚合酶、引物、荧光标记探针，制备pcr反应液。然后，将所得到的pcr反应液如上所述分成微小分组。
4、接着，利用pcr扩增各微小分组中的目标基因。pcr结束后测定各微小分组的荧光强度，对具有超过阈值的荧光强度的微小分区的数量进行计数。根据所得到的值，能够算出检测体所含的目标基因的量。
5、在这样的数字pcr中，由于使用极限稀释后的检测体，因此能够抑制成为阻碍pcr的反应的主要原因的来自检测体的成分的影响。另外，由于不需要标准曲线，因此能够直接测定作为对象的dna的绝对量。
6、然而，在以往的pcr中，由于反应液中的反应抑制物的存在、模板dna
7、另一方面，在数字pcr中，在反应的终点检测dna为0还是为1，因此可以认为pcr的反应效率本身对测定结果的影响不大。但是实际上，即使在终点进行测定，由各微小分组间反应效率不均匀引起的荧光强度的偏差也大。这成为使得数字pcr的测定再现性和测定精度降低的原因。
8、因此，本专利技术的专利技术人为了提高数字pcr的测定再现性和测定精度，开发了如下技术：利用熔解曲线分析测定pcr扩增产物的熔解温度(tm)，由此即使各微小分组间的pcr反应效率不均匀，也能够判断各微小分组内的目标基因的有无(专利文献5)。
9、现有技术文献
10、专利文献
11、专利文献1：日本特表2013-521764号公开公报
12、专利文献2：美国专利第4683195号公报
13、专利文献3：美国专利第4683202号公报
14、专利文献4：美国专利第4800159号公报
15、专利文献5：日本特开2018-108063号公开公报
16、非专利文献
17、非专利文献1：genome res.，10，pp986-994，1996
技术实现思路
1、专利技术所要解决的技术问题
2、然而，在使用了熔解曲线分析的数字pcr中，在获取用于计算tm的荧光图像时，如果在装有检测体的微小分组的微小分区(microcompartment)附近产生气泡，则会发生tm值被计算成错误的值的问题。在使用了熔解曲线分析的数字pcr中，将检测体分割成微小分组，在配置于平面上的微小分区内，将微小分组中的目标基因扩增后，一边改变温度一边获取微小分区的荧光图像，在每个微小分区根据荧光强度变化算出微小分组内的基因的熔解温度。此时，在荧光图像获取中温度成为高温时就容易产生气泡。特别是在作为微小分区使用设置于基板的贯通孔并将添加在贯通孔中的pcr反应液用油等封住使反应发生的情况、或将油中的微滴在流路内在平面上排列而使反应发生的情况等，有时会在油中产生气泡。由于产生的气泡在获取荧光图像时移动，各微小分区的荧光强度会发生变动，而成为熔解曲线的噪声。其结果，有时算出与微小分区内的基因的熔解温度不同的数值，无法正确进行目标基因的定量。
3、因此，本专利技术的目的在于提供一种新的dna检测方法和dna检测系统，其在使用了熔解曲线分析的数字pcr中，通过测定装置探测位于产生的气泡附近的微小分区，高精度地对目标基因进行计数。
4、用于解决技术问题的技术方案
5、本专利技术的专利技术人在使用了熔解曲线分析的数字pcr中，对算出了与添加的检测体所含的基因型不同的熔解温度的微小分区进行分析，结果得知这样的微小分区的位置发生偏倚，而且其原因是气泡的存在。由此，发现通过将位于气泡附近的微小分区从分析数据中去除，基因型的错误判定降低，从而完成了本专利技术。
6、本专利技术的一个实施方式为一种dna检测方法，其包括：将含有荧光标记探针或dna嵌入剂和多种检测对象的dna的检测体溶液分隔成多个微小组分的第一工序；在包含上述微小组分的微小分区中进行核酸扩增反应的第二工序；在各个上述微小分区中，伴随温度变化，测定来自上述荧光标记探针或上述dna嵌入剂的荧光强度的第三工序；根据上述测定得到的各荧光强度计算上述检测对象的dna的熔解温度的第四工序；确定受到了气泡的影响的上述微小分区的第五工序；和从上述多个微小分区得到的总数据除去上述受到了气泡的影响的上述微小分区的数据的第六工序。在第五工序中，作为上述受到了气泡的影响的上述微小分区，可以确定为根据第三工序中测定得到的各荧光强度制作的熔解曲线的微分曲线的峰数为规定值以上的微小分区。另外，在第五工序中，可以在相邻的2个以上的上述微小分区被确定为上述受到了气泡的影响的上述微小分区的情况下，在第六工序中，将该相邻的2个以上的上述微小分区的数据除去，且在第五工序中，单独的上述微小分区被确认到上述受到了气泡的影响的上述微小分区的情况下，在第六工序中，不除去该单独的上述微小分区的数据。另外，在第五工序中，上述受到了气泡的影响的上述微小分区可以通过上述微小分区的图像的解析来确定。另外，在第五工序中，可以选择从第三工序中测定得到的各荧光强度制作的熔解曲线的微分曲线的峰数为规定值以上的微小分区，通过上述选择的微小分区的图像的解析确认是否受到上述气泡的影响，由此确定上述受到了气泡的影响的上述微小分区。另外，在第五工序中，可以在相邻的2个以上的上述微小分区中，选择上述微分曲线的峰数为规定值以上的微小分区，且在第五工序中，在单独的上述微小分区中，不选择上述微分曲线的峰数为规定值以上的微小分区。此外，在第一工序中，上述dna溶液可以被极限稀释。在第四工序中，可以在上述各微小分区中，根据上述熔解温度，判断上述多个检测对象的dna的种类，在第五工序中，对于判断了种类的上述dna的各种类，进一步根据表示规定的基准熔解温度的信息来确定上述微小分区。上述微小分区可以由以阵列状排列的孔或分散在油中的微滴构成。在第四工序中，上述熔解温度可以作为从第三工序中测定得到的各荧光强度制作的熔解曲线的拐点算出。
7、本专利技术的另一个实施方式为一种dna检测系统，其包括：具有用于加入含有荧光标记探针或dna嵌入剂的dna溶液的多个微小分区的第一装置；用于拍摄第一装置的图像的第二装置本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种DNA检测方法，其特征在于，包括：
2.如权利要求1所述的DNA检测方法，其特征在于：
3.如权利要求1或2所述的DNA检测方法，其特征在于：
4.如权利要求1所述的DNA检测方法，其特征在于：
5.如权利要求1所述的DNA检测方法，其特征在于：
6.如权利要求5所述的DNA检测方法，其特征在于：
7.如权利要求1～6中任一项所述的DNA检测方法，其特征在于：
8.如权利要求1～7中任一项所述的DNA检测方法，其特征在于：
9.如权利要求1～8中任一项所述的DNA检测方法，其特征在于：
10.如权利要求1～9中任一项所述的DNA检测方法，其特征在于：
11.一种DNA检测系统，其特征在于，包括：
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种dna检测方法，其特征在于，包括：
2.如权利要求1所述的dna检测方法，其特征在于：
3.如权利要求1或2所述的dna检测方法，其特征在于：
4.如权利要求1所述的dna检测方法，其特征在于：
5.如权利要求1所述的dna检测方法，其特征在于：
6.如权利要求5所述的dna检测方法，其特征在于：...
【专利技术属性】
技术研发人员：田中淳子，中川树生，石田猛，香村惟夫，
申请(专利权)人：株式会社日立高新技术，
类型：发明
国别省市：
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