与鸭６周龄体重性状连锁的微卫星标记、其试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术提供了与鸭６周龄体重性状连锁的微卫星标记、其检测试剂盒及应用，本发明专利技术微卫星标记，是引物对ＳＥＱ?ＩＤ?Ｎｏ．２＆３的扩增产物，其优势基因型如ＳＥＱ?ＩＤ?Ｎｏ．１所示。本发明专利技术微卫星标记及试剂盒可用于鸭的辅助育种，快速准确的辅助筛选，具有早期筛选、节省时间、成本低廉、准确性高的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及与鸭6周龄体重性状连锁的微卫星标 记、其检测试剂盒及应用。
技术介绍
微卫星又称为简单序列重复(Sample Sequence R印eats，SSR)，一般以1-6个碱 基为核心序列，首尾相连组成的串联重复序列。这种序列存在于几乎所有真核生物的基因 组中，基因的间隔区和内含子以及外显子和调控区均有微卫星的分布。不同物种中，微卫星 序列的含量各不相同，真核生物平均每50-150kb就存在一个微卫星位点，人类基因组中每 间隔6kb存在一个微卫星位点，鸟类基因组中则每间隔20-39kb存在一个微卫星位点。并 且各种微卫星序列的丰度在不同物种中也各不相同。例如，在人类及哺乳类动物基因组中， 最丰富的微卫星序列是(AC)n;而在植物基因组中则以(AT)n最多。在真核生物基因组中， 二核苷酸微卫星序列最为丰富，三核苷酸微卫星的序列含量比二核苷酸微卫星序列大约低 10倍，而四核苷酸微卫星的微卫星序列则相对较少。与其它分子标记相比，微卫星标记具有以下特点(1).广泛随机分布于真核生物 基因组中，外显子和内含子皆有分布；(2).可根据微卫星两侧的保守性侧翼序列设计引 物，通过PCR扩增检测其多态性；(3).高度多态，信息含量高；(4).进化上分离时间短的 物种间微卫星侧翼序列保守性较高，如Reed等用鸡的特异性微卫星引物扩增火鸡基因组， 54%的引物具有PCR扩增产物(5).共显性遗传；(6).微卫星的序列一般较短，即使是部分 降解的DNA也可能有足够用来扩增的微卫星序列，这一点更优于RAPD和更长目的基因序列 的VNTR，因而在古DNA的研究及法医学鉴定中具有重要的应用价值；(J).随着毛细管电泳 技术及相关技术的发展，全自动化的大规模基因型分析已成为可能。自1974年Skirmer等首先发现微卫星以来该标记被广泛应用于生物进化、遗传 学鉴定、种质资源分析及遗传图谱的构建、功能基因和数量性状的定位等研究。目前，寻找 微卫星位点的方法主要有以下三种(1).基因组文库法目前用于微卫星研究的基因组文 库分为三类小插入片段文库、大插入片段文库及染色体特异文库。小插入片段文库由于 便于后续微卫星结构的研究，得到广泛应用。小片段插入文库中的插入片段大小一般为 200-600bp，具体做法是用几种限制性内切酶消化总DNA，然后用琼脂糖凝胶分离酶切片 段，回收200-600bp的片段，再与相应的载体连接并转化特异菌系，应用标记了放射性元素 的核心重复序列探针，通过放射性杂交筛选含有目标重复序列的阳性克隆，最后测定阳性 克隆的序列克隆微卫星位点。(2).比较基因组学研究方法随着人类基因组计划测序工作 的完成及其它重要经济性状动植物基因组计划地开展，生物学家将对模式生物的分子遗传 学基础有更深刻地认识和了解，如何利用模式生物的大量生物信息、借助于比较基因组学 的研究方法进行其它物种动植物的分子遗传学研究将是本世纪生物学的重要研究内容，微 卫星标记的分离也不例外，猪、牛、鸡等重要经济动物大量微卫星标记的筛选为相近物种及 多种物种通用微卫星标记的分离提供了可能。该方法应用微卫星标记较多的物种进行相近物种的PCR扩增，从中筛选出一些具有特异性扩增产物、扩增片段大小与原物种接近的多 态位点，而对于扩增片段大小与原物种有差异的物种通过测序后分析是否是多态微卫星标 记。该方法的优点是可筛选出一些通用于某些物种进化研究及构建比较遗传图谱的多态微 卫星标记。体重是鸭质量性状中重要的一项，它能够反应禽类的生长发育状况，对养殖至关 重要。对鸭体重这一性状的微卫星标记，能够为辅助育种提供有效参数，提高育种效率。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种与鸭6周龄体重(W6)性状连锁的微卫星标记、其检测试 剂盒及应用。本专利技术通过设计微卫星引物并荧光标记微卫星引物，利用PCR扩增得到不同长 度的微卫星片段，在ABI测序仪GS-RUN-360-P0P4default module下电泳，电泳结果用 GenesScan3. 7和Genemapper分析扩增片段大小，利用Crimap2. 4软件构件基因遗传连锁图 谱。在构建的基因遗传图片的基础上，用Haley回归区间定为法对重要经济性状进行QTL 定位，定位采用模型为y = μ +P (Q | M) +e其中μ为群体平均数；P(Q|M)为已知标记基因型时，QTL标记基因型的概率；Cal为群体中第i个个体在给定座位的加性组分的回归系数；A为QTL的加性效应；Cdl为群体中第i个个体在给定座位的显性组分的回归系数；D为QTL的显性效应；e为残差效应。结果发现，由引物SEQ ID No. 2&3标志的微卫星标记与6周龄体重(W6)性状相连 锁。进而，本专利技术提供用于鸭6周龄体重(W6)筛选的微卫星标记，其中优势等位基因为SEQ ID No. 1所示的微卫星标记。本专利技术进一步提供用于扩增上述微卫星标记的引物。在本专利技术优选的实施方案中 所述引物序列为Pf:TGGTGCGATGAGCTGAGAT,Pr GCTTTAGTTTTTCAATTAGGTG 进一步，本专利技术还提供含有上述引物的试剂盒。该试剂盒还进一步包括以下试剂 中的一种或多种PCR缓冲液、Mg2+、DNA聚合酶、dNTPs。本专利技术微卫星标记及试剂盒可用于鸭的辅助育种，快速准确的辅助筛选，具有早 期筛选、节省时间、成本低廉、准确性高的优点。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。随机采自北京金星鸭业中心的15个鸭群体(A-O)的各40个鸭个体血样，群体包 括2个北京鸭保种群体M和N，2个从英国樱桃谷公司引进的樱桃谷鸭品系(C、D)，11个北 京鸭人工选育品系(A、B、E-L、0)实施例1微卫星标记与体重性状的关联1、引物信息5，端标记有HEX或FAM亚磷酸酰胺荧光基团的引物表1 2.禽血的采取及处理鸭厂采集到15个家系共约650个个体的纯种北京鸭血液样品，翅静脉采血，每一 个体采取0. 5ml血样，加入0. 2ml抗凝剂，充分混勻。常温带回实验室后，以1 9比例加 入禽血裂解液，常温裂解抗凝血48小时后_20°C保存备用。3..鸭基因组DNA的提取(1)取0. 4ml裂解血(Iml血液加9ml禽血裂解液)放入1. 5ml离心管中，视情况 补加TE稀释；(2)加入蛋白酶k至终浓度200 μ g/ml，混勻，55°C水浴消化24_36小时，视情况补 加蛋白酶K，继续消化；(3)加入等体积Tris饱和酚，轻摇lOmim，12000rpm离心IOmin ；(4)将上清转移至新离心管中；(5)用等体积的酚氯仿(1 1)和氯仿各抽提一次；(6)上层水相加入1/10体积乙酸钠(pH5. 2)和2倍体积无水乙醇沉淀DNA，室温 沉淀Imin左右至致密的絮状DNA出现；(7)用干净的Tip枪头把DNA挑出放入新离心管，用70%的乙醇洗涤DNA沉淀两 次，真空抽干后加入100本文档来自技高网...

【技术保护点】
与鸭６周龄体重性状连锁的微卫星标记，其为以下引物的扩增产物：　　Ｐｆ：ＴＧＧＴＧＣＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＧＡＴ，　　Ｐｒ：ＧＣＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＣＡＡＴＴＡＧＧＴＧ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李宁，黄银花，吴非，
申请(专利权)人：李宁，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]