【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及大脑类器官，尤其涉及一种含小胶质细胞的大脑类器官及其制备方法和应用。
技术介绍
1、人脑类器官(brain organoid)是人多能干细胞(hpsc)在体外经诱导分化自发形成的，具有多种细胞构成的器官样组织，该模型在结构和功能上较为真实地还原了人类大脑组织的生理及病理特征；且患者来源的诱导多能干细胞(ipsc)分化的人脑类器官携带有患者的遗传信息，可作为研究人类特有脑疾病机制的优良模型，在生物医学及药物临床前测试中具有广阔前景。
2、目前相对于其他大脑类器官制作方法，兰卡斯特制作方法(lancaster ma,rennerm,martin ca,et al.cerebral organoids model human brain development andmicrocephaly[j].nature,2013,501(7467):373-379)是现今效率最高，最稳定的一种大脑类器官制作方法。但是，此种类脑有一个重大缺点，它缺少来源于中胚层的小胶质细胞(microglia,mg)，而小胶质细胞对于神经元的成熟和突触的形成来说是必不可缺的一类细胞，其在大脑的发育成熟过程中扮演了极其重要的作用。现今制作含小胶质的类脑方法很多，大约分成三种：1、将大脑类器官与人永生小胶质细胞共培养；2、应用同一来源的干细胞分别分化为小胶质细胞及大脑类器官进行共培养；3.将人类大脑类器官植入大鼠脑中，与鼠脑中的小胶质细胞相融合。但是，这种外源性的小胶质细胞是否能够与大脑类器官完美融合，发挥如同人类大脑中本身的小胶质细胞的
3、有研究表明，炎症刺激下，外源性植入的小胶质细胞与大脑类器官培养过程中自发形成小胶质细胞功能存在一定差异。因此相比较于外源性小胶质细胞的植入，更倾向于大脑类器官自发的分化出小胶质细胞。但是目前这种方法存在以下问题：①类脑中的小胶质细胞数量不稳定；②mg类脑不易存活。因此，如何高效制备含小胶质细胞的3d大脑类器官成为了亟需解决的问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种高效制备含小胶质细胞3d大脑类器官方法。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种大脑类器官的制备方法，包括如下步骤：
4、(1)培养人诱导多能干细胞，5～7天传代一次，选取未分化的人多能诱导干细胞；
5、(2)分离步骤(1)选取的细胞，分离后的细胞与eb种子培养基混合制备细胞悬液；
6、(3)培养所述细胞悬液，分别在培养的第47～49h、95～97h，加入eb形成培养基，4～5天后选取边缘清晰，直径在300～600μm之间的胚胎体；
7、(4)将步骤(3)所述的胚胎体与神经胚层诱导培养基混合进行培养，培养46～50h后，选取出现透明不规则边缘的胚胎体进行下一步分化；
8、(5)将基质胶滴加在步骤(4)选取的胚胎体上，对胚胎体进行包裹，待基质胶凝固后，用大脑类器官扩增培养基进行培养；70～75h后，选取外侧边缘折叠的大脑类器官；
9、(6)弃去大脑类器官的扩增培养基，加入大脑类器官成熟培养基进行培养，2～3天更换一次培养基，培养14～16天，得到成熟大脑类器官；
10、所述eb形成培养基、神经胚层诱导培养基、大脑类器官扩增培养基、大脑类器官成熟培养基中含有烟酰胺单核苷酸。
11、优选的，所述人诱导多能干细胞的初始培养密度为0.8～1.2×106个/ml。
12、优选的，所述传代比例为1:4～1:6。
13、优选的，所述细胞悬液的细胞密度为85000～95000个/ml。
14、优选的，逐个对胚胎体进行基质胶包裹，所述每个胚胎体对应的基质胶的体积为20～25μl。
15、优选的，包裹基质胶的胚胎体在6孔低附板中培养，每个孔放置6～8个胚胎体。
16、优选的，烟酰胺单核苷酸在eb形成培养基、神经胚层诱导培养基、大脑类器官扩增培养基、大脑类器官成熟培养基中的浓度分别为180～220μm。
17、优选的，步骤(1)～(6)所述培养的条件为：4～6％co2，35～40℃。
18、本专利技术还提供了所述制备方法得到的的大脑类器官，所述大脑类器官包含小胶质细胞。
19、本专利技术提供了所述的大脑类器官在大脑发育研究、神经系统疾病研究或药物筛选中的应用。
20、通过采用上述技术方案，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术对人诱导多能干细胞进行培养，在eb形成培养基、神经胚层诱导培养基、大脑类器官扩增培养基、大脑类器官成熟培养基中分别添加180～220μm的nmn，促进了大脑类器官中小胶质细胞的发育，加速了神经元以及神经元突触的发育，还能促进大脑类器官中前脑、前皮质板、海马、脉络丛以及后脑的发育，得到了能够自发分化出小胶质细胞的大脑类器官，在大脑发育研究、神经系统疾病研究或药物筛选等方面具有重大意义。
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1.一种大脑类器官的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述人诱导多能干细胞的初始培养密度为0.8～1.2×106个/mL。
3.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，所述传代比例为1:4～1:6。
4.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，所述细胞悬液的细胞密度为85000～95000个/mL。
5.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，逐个对胚胎体进行基质胶包裹，所述每一个胚胎体对应的基质胶的体积为20～25μL。
6.根据权利要求1或5的制备方法，其特征在于，包裹基质胶的胚胎体在6孔低附板中培养，每个孔放置6～8个胚胎体。
7.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，烟酰胺单核苷酸在EB形成培养基、神经胚层诱导培养基、大脑类器官扩增培养基、大脑类器官成熟培养基中的浓度分别为180～220μM。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)～(6)所述培养的条件为：4～6％CO2，35～40℃。
9.权利要求1～8任意一项所
10.权利要求9所述的大脑类器官在大脑发育研究、神经系统疾病研究或药物筛选中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种大脑类器官的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述人诱导多能干细胞的初始培养密度为0.8～1.2×106个/ml。
3.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，所述传代比例为1:4～1:6。
4.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，所述细胞悬液的细胞密度为85000～95000个/ml。
5.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，逐个对胚胎体进行基质胶包裹，所述每一个胚胎体对应的基质胶的体积为20～25μl。
6.根据权利要求1或5的制备方法，其特征在于，包裹基...
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