【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及紫花苜蓿类钙调蛋白cml50基因及其应用。
技术介绍
1、低温、干旱、盐碱等逆境影响植物的生长和发育，造成农作物和饲草减产，也影响林木、果树、花卉、园艺观赏植物的正常生长和品质，培育耐逆的植物品种是种植业的主要目标之一。因此，从耐逆性强的植物中分离耐性基因是十分必要的。
2、类钙调素蛋白(calmodulin-like protein，cml)是植物特有的钙结合蛋白，含有2～6个ef-hand结构域，起到钙信号传感器的作用(mccormack and braam,2003)。cml结合ca2+后活化，进而与其靶蛋白结合而使后者活化，调节生理生化反应。研究发现多种类型的蛋白质都可能成为被cml识别的靶蛋白，包括蛋白激酶、转录因子、代谢酶和转运蛋白(perochon et al.,2010)。近年来研究发现cml在植物生长发育和逆境响应中都发挥着重要的作用(sun et al.,2021；yu et al.,2022)。
3、cmls在植物生长发育方面的作用已经有诸多文献报道。cml10与磷酸甘露糖变位酶(atpmm)相互作用，促进抗坏血酸的生物合成，进而调节拟南芥抗氧化胁迫能力(cho etal.,2016)。在拟南芥中，cml24可以通过依赖ca2+的信号调节植物昼夜节律，cml24通过toc1(timing of cab2 expression 1)通路与昼夜节律振荡器建立联系从而发挥作用(martiet al.,2018)。拟南芥cml25则参与ca2+介导花粉
技术实现思路
1、为克服现有技术的缺点和不足，本专利技术的首要目的是提供一种提高植物耐寒性的紫花苜蓿类钙调蛋白cml50基因。
2、本专利技术的另一目的在于提供上述紫花苜蓿类钙调蛋白cml50基因编码的蛋白。
3、本专利技术的再一目的在于提供上述紫花苜蓿类钙调蛋白cml50基因的应用。
4、本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
5、一种紫花苜蓿类钙调蛋白cml50基因，该钙调蛋白cml50基因的核苷酸序列为如下(1)或(2)：
6、(1)如seq id no.1所示的核苷酸序列；
7、(2)与(1)所述的核苷酸序列具有90％以上的同源性且具有同等功能的核苷酸序列。
8、如上所述紫花苜蓿类钙调蛋白cml50基因编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序列为如下(a)或(b)：
9、(a)如seq id no.2所示的氨基酸序列；
10、(b)由seq id no.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而形成的具有同等功能的序列。
11、含有上述的紫花苜蓿类钙调蛋白cml50基因的生物材料或用于沉默或干扰上述紫花苜蓿类钙调蛋白cml50基因的生物材料，该生物材料为重组载体、表达盒、细胞系和宿主菌中的至少一种。
12、上述的紫花苜蓿类钙调蛋白cml50基因，上述的紫花苜蓿类钙调蛋白cml50，或者上述的生物材料在提高植物耐寒性或培育耐寒性提高的转基因植物中的应用。
13、上述的应用，在目标植物中过表达所述的紫花苜蓿类钙调蛋白cml50基因提高植物的耐寒性。
14、一种提高植物耐寒性的方法，在目标植物中过表达所述的紫花苜蓿类钙调蛋白cml50基因提高植物的耐寒性。
15、作为一种优选技术方案，在目标植物中过表达所述的紫花苜蓿类钙调蛋白cml50基因的过程为：构建如上所述紫花苜蓿类钙调蛋白cml50基因的过表达载体，通过农杆菌介导法将所述的过表达载体转入到目标植物中得到耐寒性提高的转基因植株。
16、上述的植物为单子叶植物或双子叶植物，例如紫花苜蓿，但不限于此。
17、研究过程中，技术人员分别采用pcambia3301和pfgc5941构建过表达载体35s::mscml50和干扰载体mscml50-rnai，筛选压均为草丁膦。选择扦插8-12周的紫花苜蓿成熟叶片进行遗传转化，依次进行侵染、共培养、愈伤组织的诱导、愈伤组织再生和再生苗生根等过程获得转基因紫花苜蓿。
18、含有紫花苜蓿类钙调蛋白cml50基因的重组载体为重组表达载体，该重组表达载体是通过将上述紫花苜蓿类钙调蛋白cml50基因的核苷酸序列与植物表达载体连接得到的；所述的植物过表达载体优选为pcambia3301。
19、制备干扰紫花苜蓿类钙调蛋白cml50基因表达的干扰载体，所采用的载体优选为pfgc5941；
20、含有紫花苜蓿类钙调蛋白cml50基因(mscml50)的重组表达载体的制备方法，包含以下步骤：
21、(1)引物设计
22、引物⑴为mscml50扩增上游引物y4600：
23、5’-atggcaaccaatcc-3’；
24、引物⑵为mscml50扩增下游引物y4601：
25、5’-ctaattgctattggcttg-3’；
26、引物⑶为引入nco i酶切位点的上游引物y4602：
27、5’-ggggactcttgaccatggcaatggcaaccaatcc-3’；
28、引物⑷为引入bste ii酶切位点的下游引物y4603：
29、5’-gaaattcgagctggtcaccctaattgctattggcttg-3’；
30、引物⑸为引入asc i酶切位点的上游引物y4604：
31、5’-ac catgg ggcgcgccctgaaactaccaccaccaa-3’；
32、引物⑹为引入asc i酶切位点的下游引物y4605：
33、5’-tcatcgattgggcgcgccggccgttcttgtccttgtc-3’；
34、引物⑺为引入xba i酶切位点的下游引物y4606：
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1.一种紫花苜蓿类钙调蛋白CML50基因，其特征在于，该钙调蛋白CML50基因的核苷酸序列为如下(1)或(2)：
2.如权利要求1所述紫花苜蓿类钙调蛋白CML50基因编码的蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列为如下(a)或(b)：
3.含有权利要求1所述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML50基因的生物材料或用于沉默或干扰上述紫花苜蓿类钙调蛋白CML50基因的生物材料，其特征在于，该生物材料为重组载体、表达盒、细胞系和宿主菌中的至少一种。
4.权利要求1中所述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML50基因，权利要求2中所述的蛋白，或者权利要求3中所述的生物材料在提高植物耐寒性或培育耐寒性提高的转基因植物中的应用。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在目标植物中过表达权利要求1所述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML50基因提高植物的耐寒性。
6.一种提高植物耐寒性的方法，其特征在于，在目标植物中过表达权利要求1所述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML50基因提高植物的耐寒性。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在目标植物中过表达权利要
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的植物为单子叶植物或双子叶植物。
9.一种紫花苜蓿类钙调蛋白CML50启动子，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
10.权利要求9所述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML50启动子在如下(1)或(2)中的应用：
...【技术特征摘要】
1.一种紫花苜蓿类钙调蛋白cml50基因，其特征在于，该钙调蛋白cml50基因的核苷酸序列为如下(1)或(2)：
2.如权利要求1所述紫花苜蓿类钙调蛋白cml50基因编码的蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列为如下(a)或(b)：
3.含有权利要求1所述的紫花苜蓿类钙调蛋白cml50基因的生物材料或用于沉默或干扰上述紫花苜蓿类钙调蛋白cml50基因的生物材料，其特征在于，该生物材料为重组载体、表达盒、细胞系和宿主菌中的至少一种。
4.权利要求1中所述的紫花苜蓿类钙调蛋白cml50基因，权利要求2中所述的蛋白，或者权利要求3中所述的生物材料在提高植物耐寒性或培育耐寒性提高的转基因植物中的应用。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在目标植物中过表达权利要求1所述的紫花苜蓿类钙调蛋白cm...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭振飞，杨蕾，施海帆，孙洪剑，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：
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