【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病毒核酸检测领域，具体涉及一种感染性prrsv的pma-qpcr通用检测试剂盒以及一种不同感染性prrsv的pma-qpcr三重鉴别试剂盒。
技术介绍
1、猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,prrs)给我国养猪业造成巨大经济损失。其病原体prrs病毒(prrsv)是一种单股正链rna病毒，属于动脉炎病毒科(arteriviridae)。prrsv是一种快速变异的rna病毒，可分为prrsv1和prrsv2两个种(species)。我国猪群种广泛流行的是prrsv2，其中以高致病性prrsv2变异株(hp-prrsv2)、nadc30-like prrsv2和nadc34-like prrsv2为主要流行毒株。
2、尽管目前已经建立了针对hp-prrsv2、nadc30-like prrsv2和nadc34-likeprrsv2的荧光定量pcr(qpcr)检测方法，但是缺乏同时鉴别检测这三种病毒的qpcr检测方法。更为重要的是，pcr技术是通过检测扩增病毒核酸信号来定量病原，无法判断样品中病毒核酸是否具有感染性。因此，现有prrsv普通pcr和qpcr检测方法均无法区分样品中的prrsv是否具有感染性，应用于临床样品中prrsv感染情况检测分析时，容易误判样品中病毒的感染性，从而误诊动物感染情况。因此，急需研发能检测鉴别感染性prrsv毒株的方法，为我国prrs有效防控提供帮助与支持。
3、叠氮溴化丙锭(propid
4、目前pma-qpcr技术被广泛应用于不同种类活细菌检测。同时也有部分应用于感染性活病毒检测的报道。例如甲肝病毒、柯萨奇病毒等人源病毒以及猪流行性腹泻病毒和猪伪狂犬病毒等猪源病毒。但是由于pma-qpcr检测病毒感染性受到活病毒预处理、病毒灭活方法，pma用量、pma孵育时间以及光照时间等多方面因素影响，目前尚未有采用pma-qpcr技术检测并鉴别感染性prrsv毒株的报道。
技术实现思路
1、专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种感染性prrsv的pma-qpcr通用检测试剂盒以及一种不同感染性prrsv的pma-qpcr三重鉴别试剂盒，可以同时实现多种病毒的高效、高灵敏度和高特异性的通用检测与鉴别目的。
2、技术方案：本专利技术提供了一种感染性prrsv的pma-qpcr通用检测试剂盒，所述试剂盒包括一对引物对和一条探针，所述一对引物对和一条探针序列如下：
3、
4、其中，所述感染性prrsv包括所有已知的prrsv分离株。
5、其中，所述试剂盒还包括pma，所述pma浓度为1μm～5μm。
6、其中，所述感染性prrsv的pma-qpcr通用检测试剂盒，其特征在于，所述pma预处理感染性prrsv的结合温度为37℃，pma结合时间为10min，pma最佳蓝光照射光解时间为20min～25min，病毒样品灭活最佳温度为72℃～80℃，最佳灭活时间为10min～20min。
7、其中，所述探针用任意一种荧光素标记，均可选自fam、vic、hex、joe、ned、tamra、cy3、rox或cy5荧光素。
8、本专利技术还提供了一种不同感染性prrsv的pma-qpcr三重鉴别试剂盒，所述试剂盒包括三对引物对和三条探针，所述三对引物对和三条探针序列如下：
9、
10、
11、其中，所述不同感染性prrsv包括hp-prrsv2的xj17-5株、nadc30-like prrsv2的sd17-38株和nadc34-like prrsv2的rbj1805-2株。
12、其中，所述试剂盒还包括pma，所述pam浓度为5μm。
13、其中，pma最佳结合温度为37℃，pma结合时间为10min，pma最佳蓝光照射光解时间为20min，病毒样品灭活最佳温度为72℃，最佳灭活时间为10min。
14、其中，所述三条探针用任意一种荧光素标记，且探针标记的必须是使用不同检测通道的荧光素，均可选自fam、vic、hex、joe、ned、tamra、cy3、rox或cy5荧光素。
15、进一步的，本专利技术所述试剂盒还包括premix ex taq和rnase free h2o。
16、其中，所述试剂盒的扩增程序包括：
17、
18、其中，所述引物对的浓度均为10μm，所述引物对用量均为0.2～0.3μl，所述探针的浓度均为10μm，所述探针用量为0.1～0.2μl。
19、进一步的，本专利技术上述的pma-qpcr技术进行感染性prrsv通用检测和鉴别试剂盒在应用时的步骤包括：①根据上述确定的条件使用pma对病毒样品预处理，使得pma与失活病毒rna交联；②提取病毒rna并将其反转录为cdna；③使用上述引物探针组合、dna聚合酶及其他pcr反应液混合分装后，分别加入待检样品的cdna或者阴性对照、阳性对照cdna，分别进行同等条件的qpcr扩增，使用real-time pcr仪器进行荧光检测；④采集荧光信号，判定结果。判定标准如下：在阴阳性对照样品检测结果成立的情况下，待检样品的ct值《35判定为阳性。待检待检样品的ct值>35同时《40时，判定为可疑。对可疑样品进行复检时，复检样品的ct值《35判定为阳性，否则判定为阴性。待检样品的ct值>40，判定为阴性。
20、有益效果：与现有技术相比，本专利技术具备以下优点：
21、1、本专利技术使用pma-qpcr技术建立可实现感染性prrsv的通用检测和三重鉴别检测试剂盒可以排除由于普通pcr或者qpcr仍然可检测到失活prrsv的rna这一缺点所造成的对prrsv感染情况的错误判断。
22、2、本专利技术使用pma-qpcr技术建立了可实现我国感染性prrsv流行毒株的三重鉴别检测及其试剂盒可以同时鉴别检测待检样品中hp-prrsv2、nadc30-like prrsv2和nadc34-like prrsv2感染性病毒，能够快速、高效、准确的对我国猪群中不同感染性prrsv流行株感染情况进行鉴别。
23、3、本专利技术使用pma-qpcr技术建立的可实现感染性prrsv通用检测与鉴别方法及其试剂盒在保持强特异性情况下，其敏感性比普通pcr方法还要高出10-100倍。
24、4、本专利技术使用pma-qpcr技术建立的可实现感染性prrsv通用检测与鉴别方法及其试剂盒不仅可以应用于临床样品中prrsv本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括一对引物对和一条探针，所述一对引物对和一条探针序列如下：
2.一种感染性PRRSV的PMA-qPCR三重鉴别试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括三对引物对和三条探针，所述三对引物对和三条探针序列如下：
3.根据权利要求1所述的感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PMA，所述PMA浓度为1μM～5μM。
4.根据权利要求3所述的感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测试剂盒，其特征在于，所述PMA预处理感染性PRRSV的结合温度为37℃，PMA结合时间为10min，PMA最佳蓝光照射光解时间为20min～25min，病毒样品灭活最佳温度为72℃～80℃，最佳灭活时间为10min～20min。
5.根据权利要求2所述的感染性PRRSV的PMA-qPCR三重鉴别试剂盒，其特征在于，所述感染性PRRSV包括HP-PRRSV2的XJ17-5株、NADC30-like PRRSV2的SD17-38株和NADC34-lik
6.根据权利要求5所述的感染性PRRSV的PMA-qPCR三重鉴别试剂盒，其特征在于，PMA的浓度为5μM，PMA最佳结合温度为37℃，PMA结合时间为10min，PMA最佳蓝光照射光解时间为20min，病毒样品灭活最佳温度为72℃，最佳灭活时间为10min。
7.根据权利要求1所述的感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测试剂盒或权利要求5所述的三重鉴别试剂盒，其特征在于，所述探针用任意一种荧光素标记，且探针标记的必须是使用不同检测通道的荧光素，均可选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5荧光素。
8.根据权利要求1所述的感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测试剂盒或权利要求5所述的三重鉴别试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Premix Ex Taq和RNase Free H2O。
9.根据权利要求1所述的感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测试剂盒或权利要求5所述的三重鉴别试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增程序包括：
10.根据权利要求1和2所述的感染性PRRSV的PMA-qPCR通用检测试剂盒和三重鉴别试剂盒，其特征在于，所述引物对的浓度均为10μM，所述引物对用量均为0.2～0.3μL，所述探针的浓度均为10μM，所述探针用量为0.1～0.2μL。
...【技术特征摘要】
1.一种感染性prrsv的pma-qpcr通用检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括一对引物对和一条探针，所述一对引物对和一条探针序列如下：
2.一种感染性prrsv的pma-qpcr三重鉴别试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括三对引物对和三条探针，所述三对引物对和三条探针序列如下：
3.根据权利要求1所述的感染性prrsv的pma-qpcr通用检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括pma，所述pma浓度为1μm～5μm。
4.根据权利要求3所述的感染性prrsv的pma-qpcr通用检测试剂盒，其特征在于，所述pma预处理感染性prrsv的结合温度为37℃，pma结合时间为10min，pma最佳蓝光照射光解时间为20min～25min，病毒样品灭活最佳温度为72℃～80℃，最佳灭活时间为10min～20min。
5.根据权利要求2所述的感染性prrsv的pma-qpcr三重鉴别试剂盒，其特征在于，所述感染性prrsv包括hp-prrsv2的xj17-5株、nadc30-like prrsv2的sd17-38株和nadc34-likeprrsv2的rbj1805-2株。
6.根据权利要求5所述的感染性prrsv的pma-qpcr三重鉴...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈南华，齐文豪，邱悦佳，林鸿，朱建中，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：
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