【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一种表达血清11型禽腺病毒fiber蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其构建方法和应用。
技术介绍
1、禽腺病毒(fowl adenovirus，fadv)属于腺病毒科禽腺病毒属。目前，基于限制性酶切图谱分析和六邻体序列，fadv可分为5个基因型(a-e)；基于血清交叉中和试验，将5个基因型又细分为12个血清型(1-7、8a、8b、9-11)。由血清4型禽腺病毒(fadv-4)和血清11型禽腺病毒(fadv-11)感染导致的肝炎-心包积液综合征(hhs)和包涵体肝炎(ibh)给养禽业带来了巨大的经济损失。
2、目前针对禽腺病毒的防控，多利用真核表达系统表达特异性抗原蛋白，通过制备亚单位疫苗实现抗禽腺病毒感染的目的。例如fadv-4的防控，利用杆状病毒表达系统高效表达血清4型禽腺病毒fiber-2蛋白制备亚单位疫苗，能有效阻断病毒感染传播途径(cn112940084a)。针对fadv-11的防控，将禽腺病毒fiber蛋白与鸡骨髓源树突状细胞的靶向肽sp序列融合表达制备亚单位疫苗从而实现fadv-11的精准防控(cn116789850a)。由于禽腺病毒感染常伴随多种血清型出现，因此，需要针对多种血清型的禽腺病毒制备多联疫苗。例如，公开号202310094554.1的专利公开了一种禽腺病毒病四价嵌合病毒样颗粒，以新城疫病毒na-1株的基质蛋白m为骨架，将i群血清4型禽腺病毒的fiber-2蛋白、i群血清8a型禽腺病毒的fiber蛋白、i群血清8b型禽腺病毒的fiber蛋白、i群血清11型禽腺病毒的
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种表达血清11型禽腺病毒fiber蛋白的重组血清4型禽腺病毒，基于crispr-cas9技术将血清11型禽腺病毒fiber蛋白替换重组血清4型禽腺病毒中fiber-2蛋白，为同时免疫防控血清4型禽腺病毒和血清11型禽腺病毒提供技术支撑和疫苗候选。
2、本专利技术提供了一种表达血清11型禽腺病毒fiber蛋白的重组血清4型禽腺病毒，在血清4型禽腺病毒基础上，血清11型禽腺病毒fiber蛋白替换血清4型禽腺病毒中fiber-2蛋白。
3、优选的，所述血清11型禽腺病毒fiber蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示。
4、本专利技术提供了所述表达血清11型禽腺病毒fiber蛋白的重组血清4型禽腺病毒的构建方法，包括以下步骤：
5、构建含血清11型禽腺病毒fiber蛋白基因、带有血清4型禽腺病毒基因组左端同源臂、右端同源臂和带有loxp序列的rfp表达盒的供体质粒；
6、构建含靶向血清4型禽腺病毒fiber-2基因的sgrna的重组载体；
7、将所述供体质粒和含靶向血清4型禽腺病毒fiber-2基因的sgrna的重组载体转染细胞，得到的转染后的细胞接种血清4型禽腺病毒，培养后，筛选显红色荧光的细胞培养，得到带有rfp表达盒的表达血清11型禽腺病毒fiber蛋白的重组血清4型禽腺病毒；
8、将所述带有rfp表达盒的表达血清11型禽腺病毒fiber蛋白的重组血清4型禽腺病毒感染转染有cre重组酶的细胞，选择细胞病变且无红色荧光的细胞培养，得到表达血清11型禽腺病毒fiber蛋白的重组血清4型禽腺病毒。
9、优选的，构建含血清11型禽腺病毒fiber蛋白基因、带有血清4型禽腺病毒基因组左端同源臂、右端同源臂和带有loxp序列的rfp表达盒的供体质粒的构建方法，包括以下步骤：
10、扩增血清11型禽腺病毒fiber蛋白基因，通过同源重组方式与线性化的血清11型禽腺病毒fiber蛋白基因插入带有血清4型禽腺病毒基因组左端同源臂、右端同源臂和带有loxp序列的rfp表达盒的供体质粒连接；
11、所述扩增血清11型禽腺病毒fiber蛋白基因用引物包括核苷酸序列如seq id no:3的正向引物和核苷酸序列如seq id no:4所示；
12、所述带有血清4型禽腺病毒基因组左端同源臂、右端同源臂和带有loxp序列的rfp表达盒的供体质粒进行线性化处理的引物包括核苷酸序列如seq id no:5的正向引物和核苷酸序列如seq id no:6所示。
13、优选的，所述靶向血清4型禽腺病毒fiber-2基因的sgrna利用核苷酸序列如seqid no:7所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:8所示的反向引物退火得到。
14、优选的，所述血清4型禽腺病毒为表达绿色荧光蛋白的重组血清4型禽腺病毒；
15、编码绿色荧光蛋白基因在重组血清4型禽腺病毒基因组中嵌合位置为fiber-2蛋白基因上游。
16、本专利技术提供了所述表达血清11型禽腺病毒fiber蛋白的重组血清4型禽腺病毒或所述构建方法得到的表达血清11型禽腺病毒fiber蛋白的重组血清4型禽腺病毒在制备防控肝炎-心包积液综合征和/或包涵体肝炎的疫苗或药物中的应用。
17、本专利技术提供了一种防控肝炎-心包积液综合征和/或包涵体肝炎的疫苗，包括所述表达血清11型禽腺病毒fiber蛋白的重组血清4型禽腺病毒或所述构建方法得到的表达血清11型禽腺病毒fiber蛋白的重组血清4型禽腺病毒和佐剂。
18、优选的，所述佐剂包括弗式完全佐剂和/或弗式不完全佐剂。
19、本专利技术提供了一种预防和/或治疗肝炎-心包积液综合征和/或包涵体肝炎的药物，包括所述表达血清11型禽腺病毒fiber蛋白的重组血清4型禽腺病毒或所述构建方法得到的表达血清11型禽腺病毒fiber蛋白的重组血清4型禽腺病毒和药学上可接受的辅料。
20、本专利技术提供了一种表达血清11型禽腺病毒fiber蛋白的重组血清4型禽腺病毒，在血清4型禽腺病毒基础上，血清11型禽腺病毒fiber蛋白替换血清4型禽腺病毒中fiber-2蛋白。本专利技术实验表明，表达血清11型禽腺病毒fiber蛋白的重组血清4型禽腺病毒在lmh细胞上高效复制，在第5天病毒滴度最高达到109.6tcid50/ml，远远强于野生型fadv-4的生长速度和滴度。稳定性测试结果表明，连续传代后的重组病毒可以稳定表达血清11型禽腺病毒fiber蛋白。免疫原性研究表明，接种重组血清4型禽腺病毒制备的灭活油乳剂后，动物血清中抗fadv-4本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种表达血清11型禽腺病毒Fiber蛋白的重组血清4型禽腺病毒，其特征在于，在血清4型禽腺病毒基础上，血清11型禽腺病毒Fiber蛋白替换血清4型禽腺病毒中Fiber-2蛋白。
2.根据权利要求1所述表达血清11型禽腺病毒Fiber蛋白的重组血清4型禽腺病毒，其特征在于，所述血清11型禽腺病毒Fiber蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.权利要求1或2所述表达血清11型禽腺病毒Fiber蛋白的重组血清4型禽腺病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，构建含血清11型禽腺病毒Fiber蛋白基因、带有血清4型禽腺病毒基因组左端同源臂、右端同源臂和带有LoxP序列的RFP表达盒的供体质粒的构建方法，包括以下步骤：
5.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，所述靶向血清4型禽腺病毒fiber-2基因的sgRNA利用核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的反向引物退火得到。
6.根据权利要求3所述构建方法，其特征在
7.权利要求1或2所述表达血清11型禽腺病毒Fiber蛋白的重组血清4型禽腺病毒或权利要求3～6中任意一项所述构建方法得到的表达血清11型禽腺病毒Fiber蛋白的重组血清4型禽腺病毒在制备防控肝炎-心包积液综合征和/或包涵体肝炎的疫苗或药物中的应用。
8.一种防控肝炎-心包积液综合征和/或包涵体肝炎的疫苗，其特征在于，包括权利要求1或2所述表达血清11型禽腺病毒Fiber蛋白的重组血清4型禽腺病毒或权利要求3～6中任意一项所述构建方法得到的表达血清11型禽腺病毒Fiber蛋白的重组血清4型禽腺病毒和佐剂。
9.根据权利要求8所述疫苗，其特征在于，所述佐剂包括弗式完全佐剂和/或弗式不完全佐剂。
10.一种预防和/或治疗肝炎-心包积液综合征和/或包涵体肝炎的药物，其特征在于，包括权利要求1或2所述表达血清11型禽腺病毒Fiber蛋白的重组血清4型禽腺病毒或权利要求3～6中任意一项所述构建方法得到的表达血清11型禽腺病毒Fiber蛋白的重组血清4型禽腺病毒和药学上可接受的辅料。
...【技术特征摘要】
1.一种表达血清11型禽腺病毒fiber蛋白的重组血清4型禽腺病毒，其特征在于，在血清4型禽腺病毒基础上，血清11型禽腺病毒fiber蛋白替换血清4型禽腺病毒中fiber-2蛋白。
2.根据权利要求1所述表达血清11型禽腺病毒fiber蛋白的重组血清4型禽腺病毒，其特征在于，所述血清11型禽腺病毒fiber蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示。
3.权利要求1或2所述表达血清11型禽腺病毒fiber蛋白的重组血清4型禽腺病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，构建含血清11型禽腺病毒fiber蛋白基因、带有血清4型禽腺病毒基因组左端同源臂、右端同源臂和带有loxp序列的rfp表达盒的供体质粒的构建方法，包括以下步骤：
5.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，所述靶向血清4型禽腺病毒fiber-2基因的sgrna利用核苷酸序列如seq id no:7所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:8所示的反向引物退火得到。
6.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶建强，刘时，汤也，谢泉，秦爱建，邵红霞，万志敏，李拓凡，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。