【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物辅助生殖，具体的说是涉及一种高效的绵羊精子冻存预处理液和解冻液及预处理液的应用方法和绵羊精液的冷冻保存方法。
技术介绍
1、在家畜育种中，人工授精能够有效改变家畜的配种过程，提高优良种公畜的配种效率和种用价值，加快遗传进展和品种改良速度，促进育种工作进程。精液的冷冻保存是扩大人工授精范围的重要技术，但绵羊精子对冷冻保存处理敏感，冷冻-解冻后超过50％的精子活力降低或失去受精能力，且冻精常规子宫颈输精效果较差，尽管冷冻精液的腹腔镜输精可以达到较好的受胎效果，但操作过程复杂，且对操作人员的技术熟练度要求较高，同时需要昂贵的器械。因此，可用于常规子宫颈输精的绵羊精液冷冻保存技术的突破，更有利于在生产中大面积推广应用。
2、2014年，王新奇对绵羊精液进行冷冻前去精浆处理以优化绵羊冻精制作程序，结果发现绵羊细管冻精制作过程中的精液最佳平衡时间为2.5h，以4℃～-15℃区间内降温速率；5℃/min，-15℃～-90℃区间内降温速率：20℃/min冷冻降温速率最优，以1250r/min的离心速率，离心时间为5min去除精浆，能够显著提高解冻后精子活率（王新奇.绵羊精液稀释液、冷冻程序和离心除精浆的优化研究[d].内蒙古农业大学，2014.）。2022年，moradi等人分离含x和y染色体精子后，利用磁性纳米颗粒（mnps）预处理公羊精液稀释液，评估其对公羊精液冷冻保存的影响，结果发现经磁性纳米颗粒处理后精液稀释液对冷冻保存后的精液参数没有不利影响。
3、现有技术中研究的针对精液冷冻稀释液和冷冻解冻
技术实现思路
1、本专利技术为了克服现有技术存在的不足，提供一种高效的绵羊精子冻存预处理液和解冻液及预处理液的应用方法和绵羊精液的冷冻保存方法，在绵羊精液稀释前，利用添加绵羊附睾液的预处理液孵育精子，经冷冻-解冻程序后利用解冻液孵育解冻后的精子。
2、本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术公开了一种绵羊精子冻存预处理液，该绵羊精子冻存预处理液的配方为：以0.5g～0.7g葡萄糖、3.4g～3.6g乳糖和3.8mg～4.2mg bsa为基础，添加275μg/ml～285μg/ml蛋白浓度的附睾液，绵羊精子冻存预处理液在绵羊精液稀释前，利用添加蛋白浓度为280μg/ml的绵羊附睾液预处理孵育精子。
3、作为本专利技术的优选实施方式，绵羊精子冻存预处理液的配方为：以0.6g葡萄糖、3.5g乳糖和4mgbsa为基础，添加280μg/ml蛋白浓度的附睾液。
4、本专利技术还公开了一种绵羊精子冻存预处理液的制备方法，该冻存预处理液的制备方法具体包括如下步骤：
5、（1）收集健康成年公羊屠宰后的睾丸，切割阴囊外皮裸露出附睾尾，切除部分附睾尾，并对切除部分进行称重，附睾尾部用pbs浸泡5min后，收集稀释后的混合液；通过1000g离心5min将混合液中的微小组织分离，吸取上清液，再在4℃温度条件下，12000g离心10min分离附睾液与附睾液中的精子细胞，将附睾液分装后置于-20℃保存备用。
6、（2）利用bca蛋白浓度检测试剂盒测定附睾液中的总蛋白浓度，首先配制bca标准品，各取25μl标准品和附睾尾液样品加入微孔板中，每孔中加入200μl bca工作液，震荡使其充分混匀，37℃孵育30min后冷却至室温，在多功能酶标仪上562nm波长处检测吸光值，并依据标准曲线计算蛋白浓度，根据蛋白浓度确定附睾尾液添加量。
7、本专利技术公开了一种绵羊精子冻存预处理液的应用方法，在绵羊精液稀释前，利用添加绵羊附睾液的绵羊精子冻存预处理液孵育精子；绵羊精子在置于精子冻存预处理液之前，精子选用镜检活力在75％以上的精子，利用绵羊精子冻存预处理液孵育精子1h，在4℃温度条件下，600g离心10min去除预处理液，然后利用预热的精液冷冻稀释液稀释。
8、本专利技术精液冷冻稀释液的配方为：260mm～265mm tris、80mm～90mm柠檬酸、70mm～75mm葡萄糖、质量百分数为0.8％～1.2％的双抗，质量百分数为8％～12％的卵黄和质量百分数为4％～6％的甘油。
9、作为本专利技术的优选实施方式，精液冷冻稀释液的配方为：263mm tris、85mm柠檬酸、73mm葡萄糖、质量百分数为1％的双抗，质量百分数为10％的卵黄和质量百分数为5％的甘油。
10、本专利技术中的绵羊精液经过精液冷冻稀释液稀释处理后，精液采用分段降温平衡法，使稀释后的精液降温至5℃，然后进行液氮熏蒸冷冻；具体操作步骤为：稀释后的绵羊精液放入37℃水浴置于4℃冰箱中经过第一阶段降温和第二阶段降温后平衡，使绵羊精子更好的适应低温环境，稀释后的精液降温至5℃后，进行液氮熏蒸冷冻；第一阶段降温是精液自37℃下降至15℃，降温速率为0.18℃/min；第二阶段降温是精液自15℃下降至5℃，降温速率为0.09℃/min；第一阶段降温和第二阶段降温的总时间不高于4小时；精液冷冻稀释液中的精子浓度为3×108/ml。
11、本专利技术液氮熏蒸冷冻方法的具体操作步骤为：将降温平衡后的精液，在液氮面上方7cm处熏蒸10min后，投入液氮保存，50℃水浴解冻15s后，在绵羊精液解冻液中孵育30min。
12、本专利技术公开了一种用于绵羊精液冷冻后复苏的绵羊精液解冻液，绵羊精液解冻液的配方为：解冻液以dpbs为基础，添加280μg/ml蛋白浓度的附睾液。
13、本专利技术公开了一种绵羊精液的冷冻保存方法，该绵羊精液的冷冻保存方法具体包括如下步骤：
14、（1）采集绵羊精液，选择镜检活力在75％以上的精液用于冷冻保存；
15、（2）将绵羊精液在绵羊精子冻存预处理液中进行预处理；
16、（3）然后将经过预处理后的绵羊精液在精液冷冻稀释液中进行稀释；
17、（4）将绵羊精液经进行冷冻保存；
18、（5）将解冻后的绵羊精液在解冻液中孵育。
19、本专利技术绵羊精液的冷冻保存步骤具体为：将采集到的新鲜精液进行稀释液稀释，显微镜下观察，精子活力在75％以上可以进行冷冻保存。符合标准的精液，利用添加绵羊附睾液的预处理液孵育精子后，经37℃预热的冷冻稀释液稀释，放入37℃水浴中置于4℃冰箱进行分段平衡降温：第一段降温：从37℃下降至15℃，降温速率为0.18℃/min；第二段降温：从15℃下降至5℃，降温速率为0.09℃/min，降温平衡共历时4小时。绵羊精液冷冻稀释液包含：263mm tris，85mm柠檬酸，73mm葡萄糖，1％双抗，10％卵黄，5％甘油。
20、绵羊精子冻存预处理液在精子冷冻保存过程中的作用是：提高精子膜稳定性，有效降低精子的冷冻损伤，延长解冻后精子的存活时间，提高精子代谢和抗氧化能力。
21、本专利技术针对现有技术中存在本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种绵羊精子冻存预处理液，其特征在于：所述绵羊精子冻存预处理液的配方为：以0.5g～0.7g葡萄糖、3.4g～3.6g乳糖和3.8mg～4.2mg BSA为基础，添加275μg/ml～285μg/ml蛋白浓度的附睾液，所述绵羊精子冻存预处理液在绵羊精液稀释前，利用添加蛋白浓度为280μg/ml的绵羊附睾液预处理孵育精子。
2.根据权利要求1所述的绵羊精子冻存预处理液，其特征在于：所述绵羊精子冻存预处理液的配方为：以0.6g葡萄糖、3.5g乳糖和4mgBSA为基础，添加280μg/ml蛋白浓度的附睾液。
3.根据权利要求1或2所述的绵羊精子冻存预处理液的制备方法，其特征在于：所述冻存预处理液的制备方法具体包括如下步骤：（1）收集健康成年公羊屠宰后的睾丸，切割阴囊外皮裸露出附睾尾，切除部分附睾尾，并对切除部分进行称重，附睾尾部用PBS浸泡5min后，收集稀释后的混合液；通过1000g离心5min将混合液中的微小组织分离，吸取上清液，再在4℃温度条件下，12000g离心10min分离附睾液与附睾液中的精子细胞，将附睾液分装后置于-20℃保存备用。（2）利用B
4.根据权利要求1或2所述的绵羊精子冻存预处理液的应用方法，其特征在于：在绵羊精液稀释前，利用添加绵羊附睾液的绵羊精子冻存预处理液孵育精子；绵羊精子在置于精子冻存预处理液之前，精子选用镜检活力在75％以上的精子，利用绵羊精子冻存预处理液孵育精子1h，在4℃温度条件下，600g离心10min去除预处理液，然后利用预热的精液冷冻稀释液稀释。
5.根据权利要求4所述的绵羊精子冻存预处理液的应用方法，其特征在于：所述精液冷冻稀释液的配方为：260mM～265mM Tris、80mM～90mM柠檬酸、70mM～75mM葡萄糖、质量百分数为0.8％～1.2％的双抗，质量百分数为8％～12％的卵黄和质量百分数为4％～6％的甘油。
6.根据权利要求4所述的绵羊精子冻存预处理液的应用方法，其特征在于：所述精液冷冻稀释液的配方为：263mM Tris、85mM柠檬酸、73mM葡萄糖、质量百分数为1％的双抗，质量百分数为10％的卵黄和质量百分数为5％的甘油。
7.根据权利要求1或2所述的绵羊精子冻存预处理液的应用方法，其特征在于：绵羊精液经过精液冷冻稀释液稀释处理后，精液采用分段降温平衡法，使稀释后的精液降温至5℃，然后进行液氮熏蒸冷冻；具体操作步骤为：稀释后的绵羊精液放入37℃水浴置于4℃冰箱中经过第一阶段降温和第二阶段降温后平衡，使绵羊精子更好的适应低温环境，稀释后的精液降温至5℃后，进行液氮熏蒸冷冻；所述第一阶段降温是精液自37℃下降至15℃，降温速率为0.18℃/min；所述第二阶段降温是精液自15℃下降至5℃，降温速率为0.09℃/min；第一阶段降温和第二阶段降温的总时间不高于4小时；所述精液冷冻稀释液中的精子浓度为3×108/ml。
8.根据权利要求7所述的绵羊精子冻存预处理液的应用方法，其特征在于：所述液氮熏蒸冷冻方法的具体操作步骤为：将降温平衡后的精液，在液氮面上方7cm处熏蒸10min后，投入液氮保存，50℃水浴解冻15s后，在绵羊精液解冻液中孵育30min。
9.一种用于绵羊精液冷冻后复苏的绵羊精液解冻液，其特征在于：所述绵羊精液解冻液的配方为：解冻液以DPBS为基础，添加280μg/ml蛋白浓度的附睾液。
10.一种绵羊精液的冷冻保存方法，其特征在于：所述绵羊精液的冷冻保存方法具体包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种绵羊精子冻存预处理液，其特征在于：所述绵羊精子冻存预处理液的配方为：以0.5g～0.7g葡萄糖、3.4g～3.6g乳糖和3.8mg～4.2mg bsa为基础，添加275μg/ml～285μg/ml蛋白浓度的附睾液，所述绵羊精子冻存预处理液在绵羊精液稀释前，利用添加蛋白浓度为280μg/ml的绵羊附睾液预处理孵育精子。
2.根据权利要求1所述的绵羊精子冻存预处理液，其特征在于：所述绵羊精子冻存预处理液的配方为：以0.6g葡萄糖、3.5g乳糖和4mgbsa为基础，添加280μg/ml蛋白浓度的附睾液。
3.根据权利要求1或2所述的绵羊精子冻存预处理液的制备方法，其特征在于：所述冻存预处理液的制备方法具体包括如下步骤：（1）收集健康成年公羊屠宰后的睾丸，切割阴囊外皮裸露出附睾尾，切除部分附睾尾，并对切除部分进行称重，附睾尾部用pbs浸泡5min后，收集稀释后的混合液；通过1000g离心5min将混合液中的微小组织分离，吸取上清液，再在4℃温度条件下，12000g离心10min分离附睾液与附睾液中的精子细胞，将附睾液分装后置于-20℃保存备用。（2）利用bca蛋白浓度检测试剂盒测定附睾液中的总蛋白浓度，首先配制bca标准品，各取25μl标准品和附睾尾液样品加入微孔板中，每孔中加入200μl bca工作液，震荡使其充分混匀，37℃孵育30min后冷却至室温，在多功能酶标仪上562nm波长处检测吸光值，并依据标准曲线计算蛋白浓度，根据蛋白浓度确定附睾尾液添加量。
4.根据权利要求1或2所述的绵羊精子冻存预处理液的应用方法，其特征在于：在绵羊精液稀释前，利用添加绵羊附睾液的绵羊精子冻存预处理液孵育精子；绵羊精子在置于精子冻存预处理液之前，精子选用镜检活力在75％以上的精子，利用绵羊精子冻存预处理液孵育精子1h，在4℃温度条件下，600g离心10min去除预处理液，然后利用预热的精液冷冻稀释液稀释。
【专利技术属性】
技术研发人员：张家新，徐冰冰，张纬航，张健，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：
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